Khóa luận Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây xuân hoa (pseudranthemum palatiferum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii 1 LỜI CẢM TẠ Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những ngƣời thân đã nuôi dƣỡng và giáo dục con nên ngƣời. Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành biết ơn: - TS. Phan Phƣớc Hiền. - Kỹ sƣ Trịnh Phi Ly. Đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu đã tận tình giúp đỡ trong việc lấy mẫu lá Xuân Hoa và đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn. - TS. Nguyễn Ngọc Hải, Phòng Vi Sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm. - Cô và Chú Đinh Công Bảy, chủ cơ sở trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã tận tình giúp đỡ và cung cấp số lƣợng lớn lá Xuân Hoa. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. iv TÓM TẮT Đỗ Thị Tuý Phƣợng, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2007. “ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phan Phƣớc Hiền Đề tài đƣợc tiến hành tại: - Phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 15/3/2007 đến 30/7/2007. Nội dung tiến hành: - Tiến hành chiết tách các phân đoạn từ cao kháng khuẩn nhất bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. - Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội. - Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH. Kết quả đạt đƣợc: - Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ ức chế tối thiểu là : MICE. coli = 500 µg/ml. v MICsalmonella= 500 µg/ml. - Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn và xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn là XH9, XH10, XH11, XH12, XH13. - Tiến hành tách chiết trên phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn này thu đƣợc 2 hợp chất XH-K11 và XH-K13. - Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã định danh đƣợc XH-K11 là apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất XH-K13 là β- sitosterol-3-O- β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5. - Khảo sát tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa cho thấy hàm lƣợng các phân tử ức chế DPPH là khá cao (85,7%), thông qua so sánh chỉ số IC50 của mẫu Xuân Hoa với Vitamin C: IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vi SUMMARY Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City. “Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa leaves”. Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Content: - Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that researching antibacterial property of these fractions for E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these antibacterial fractions. - Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process. Result: - Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with : MICE. coli = 500 µg/ml. MICsalmonella= 500 µg/ml. - Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction. - Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin 7-O-β- glucoside and β- sitosterol-3-O- β-glucoside. - Determination of antioxidant property of Xuan Hoa extract shows that the molecular volume which inhibits oxidant activity is high (85,7% Vitamin C): IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vii MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm Tắt ......................................................................................................................... iv Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ ...................................................................................... xii Danh sách các bảng và sơ đồ ....................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 2 1.2. Mục đích - Yêu cầu ................................................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa ................................................................................... 3 2.1.1. Đặc điêm thực vật học ......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 3 2.1.3. Phân bố ................................................................................................................ 4 2.1.4. Nhân giống .......................................................................................................... 4 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa ................................................................................ 4 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian ................................................................................. 4 2.2.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 5 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan ............................................................................................. 5 2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo ............................................................... 10 2.3. Thành phần hóa học ............................................................................................... 13 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ..................................................... 15 viii 2.4.1. Alcaloid ............................................................................................................... 15 2.4.2. Flavonoid ............................................................................................................. 16 2.4.3. Tinh dầu .............................................................................................................. 16 2.4.4. Saponin ................................................................................................................ 17 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột ........................................................................ 17 2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 17 2.5.2. Hình thể ............................................................................................................... 17 2.5.3. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................... 18 2.5.4. Đặc tính sinh hóa ................................................................................................. 18 2.5.5. Sức đề kháng ....................................................................................................... 19 2.5.6. Độc tố .................................................................................................................. 19 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên........................................................................................ 19 2.5.8. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 21 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm .............................................................. 21 2.6.1. Staphyl ococcus aureus ....................................................................................... 21 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa.................................................................................... 21 2.6.3. Escherichia coli ................................................................................................... 21 2.6.4. Salmonella ........................................................................................................... 22 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH ............................................................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...................................................... 24 3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 24 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................................. 24 3.2.1. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2.2. Thời gian ............................................................................................................. 25 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 25 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 25 3.3.2. Hóa chất .............................................................................................................. 27 ix 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ........................................................................................... 28 3.4.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................................ 28 3.4.2. Điều chế các loại cao ........................................................................................... 28 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa .................................................................................. 28 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform .................................................................................. 29 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol..................................................................................... 29 3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc ............................................................................................ 29 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao ....................................................... 31 3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform ........................................................ 32 3.4.4.1. Sắc ký cột ........................................................................................................ 32 3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 35 3.4.4.3. Sắc ký điều chế ................................................................................................ 37 3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn ............................................................................. 38 3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc tách chiết từ cao chloroform ....................................................................................................................................... 38 3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH ...................................................... 40 3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH ................................................................... 40 3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH ................................................. 40 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 44 4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết .................................... 44 4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng .................... 45 4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform ................................................................ 45 4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. ................................................ 47 4.2.2.1. Phân đoạn XH11 .............................................................................................. 47 4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 ................................................................................. 47 4.2.2.3. Phân đoạn XH13 .............................................................................................. 48 4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. ............................................................... 49 x 4.3.1. Chất XH-K13 ...................................................................................................... 49 4.3.2. Chất XH-K11 ...................................................................................................... 50 4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform. .................................................................................................................... 52 4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa ................................................................. 55 4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C ....................................................................... 55 4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa .................................................. 56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 58 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 58 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 62 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infirm C Chloroform Cfu Colony forming unit COSY Correclation Spectroscopy d Double: mũi đôi DEPT Distortionlees Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethylsulfuoxid DPPH 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl E Ete dầu hỏa HMBC Heteronuclear multiple bond correction HSQC Heteronuclear single quantum coherence IC50 Inhibitory Concentration 50: nồng độ ức chế 50% DPPH IR Infrared Spectrometry: hồng ngoại J Coupling constant: hằng số ghép cặp LD50 Lethal dose 50: liều gây chết 50% số cá thể m Multiplet: mũi đa Me Methanol MIC Minimum Inhibitory Concentration: nồng độ ức chế tối thiểu MS Mass Spectrometry: khối phổ Nt Nhƣ trên NMR Nuclear Magnetic Resonnace: cộng hƣởng từ hạt nhân Rf Retention factor s Single: mũi đơn t Tripplet: mũi ba TSA Tryptic Soy Agar xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cây Xuân Hoa............................................................................................. 3 Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê ........................................................................ 29 Hình 3.2: Chất phân tích đã đƣợc đƣa vào cột sắc ký ................................................... 33 Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng ................................................................... 36 Hình 3.4: Sắc ký điều chế ............................................................................................. 37 Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH vào ................................................................................................................................. 43 Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella ............................. 44 Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng ........................................................................ 47 Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng ........................................................................ 48 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli ................................... 52 Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 ........................................... 53 Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 ........................ 54 Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 .......................... 54 Đồ thị 4.1: Vitamin C .................................................................................................... 55 Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa........................................................................................ 56 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột ...................................................................... 7 Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng ................................................................................................................................ 9 Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột ..................... 9 Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan ......................................................................... 10 Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân