Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KỸ THUẬT AFLP ( AMPLIFIED FRAGMENTS LENGTH POLYMORPHISM) BỘ MÔN: KỸ THUẬT DI TRUYỀN GVHD: TS.TRẦN THỊ DUNG NHÓM THỰC HIỆN: MSSV TƯỞNG THÙY NHI 61303689 NGUYỄN THỊ KIỀU OANH 61303701 ĐÀM THỊ HUYỀN 61303558 MỤC LỤC GIỚI THIỆU NGUYÊN TẮC HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH ƯU, NHƯỢC ĐIỂM ỨNG DỤNG KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO GIỚI THIỆU Trong những năm 1990, công ty Keygene phát triển kỹ thuật AFLP ( Amplified Fragments Length Polymorphism). AFLP là sự kết hợp giữa RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) và PCR( polymerase chain reaction) là sự đa hình các đọan do cắt bởi RE và khuếch đại nhanh nhiều bản sao. AFLP là sự đa hình các đọan khuếch đại( DNA) AFLP là: - Một trong những kỹ thuật in dấu DNA được phát triển bởi Vos và cộng sự - Không cần biết trước trình tự DNA - Ước lượng độ đa dạng của di truyền trong và giữa những quần thể với nhau. NGUYÊN TẮC Tương tự RFLP, nhưng không cần tiến hành lai phân tử, dựa vào độ đặc hiệu cao enzyme cắt giới hạn( RE) đối với vị trí của chúng trên DNA của gene. Sư khác biệt giữa hai cá thể tạo ra những phân đọan cắt khác nhau. kỹ thụật AFLP gồm hai nội dung cơ bản: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn có bổ sung các adaptor đặc trưng cho các đọan mồi đã được chọn trước. các enzyme thường dung là EcoRI và MseI. Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR, ngắt quãng với hai lọai mồi khác nhau, mồi của phản ứng PCR thiết kế trình tự adaptor+ trình tự vài nucleotide. Đọan DNA chứa trình tự adaptor+ trình tự nucleotide chọn lọc( khuếch đại). Các trình tự chọn lọc này: + Giảm lượng sản phẩm PCR + Đơn giản quá trình phân tích HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ Nguồn: Nước và nước đã khử ion( deionized water) Hóa chất Trang thiết bị - Tủ lạnh, tủ đông sâu - Laminar có dòng hút khí - Máy li tâm - Máy PCR - Máy đo pH - Cân chuẩn - Máy điều chỉnh nguồn điện - Máy điện di phương thẳng đứng - Lò hâm( hotplate) - Máy giải trình tự tự động hoặc lò vi sóng - Máy soi bằng cực tím 3. Dụng cụ Các lọai micropipette và pipette tip tương ứng( đầu côn) Các lọai tube eppendorf Cồi chày sứ Găng tay CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Phân lập DNA Phá vỡ màng tế bào: nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết lọai bỏ các thành phần không mong muốn( thường là protein) tủa DNA => bảo quản ở -20C Digestion và Ligation Dùng hai enzyme giới hạn EcoRI có trình trình tự nhận biết 6 base, và MseI ( thường có 256 bases) có trình tự nhân biết 4 base, cắt khuôn thành những phân đọan. Hai enzyme giới hạn này được sắp xếp lại nhờ kết hợp với hai hai adaptor có cấu trúc làm cho dây DNA không trở lại hình dạng ban đầu. MseI      5’TTAA3’                    EcoRI    5’GAATTC3’ Nối EcoRI adaptor và MseI adaptor, là những oligonucleotide, sợi đôi gắn vào hai đầu phân đọan DNA. Cấu trúc của hai adaptor: EcoRI site:    5' CTCGTAGACTGCGTACC    5' AATTGGTACGCAGTCTAC   MseI site:    5' GACGATGAGTCCTGAG  Sau đây là mô hình của 2 hiện tượng trên //-------GAATTC------//------TTAA------// //-------CTTAAG------//------AATT------//  EcoRI               MseI DNA sequence with  EcoRI and MseI  recognition sequences //-------G     AATTC------//------T     TAA------// //-------CTTAA     G------//------AAT     T------// DNA restriction Chạy PCR với các lọai mồi chọn lọc, các mồi này được cấu tạo gồm 3 phần: Trình tự nòng cốt( CORE), trình tự enzyme( ENZ), trình tự chọn lọc (EXT). Nhờ vậy, những phân đoạn có Nu bổ sung với Nu chọn lọc được nhân lên. Những đọan DNA ngắn có chứa một đầu là primer MseI và một đầu là EcoRI được khuếch đại đáng kể, DNA gắn hai đầu là EcoRI ít khuếch đại hơn , DNA gắn hai đầu là MseI => đóng vòng. Sản phẩm tiền khuếch đại được pha loãng được dùng làm vật liệu để khuếch đại với đọan mồi huỳnh quang . Khuếch đại Sản phẩm PCR của bước tiền khuếch đại được dùng làm khuôn cho bước khuếch đại sau đó, sử dụng primer có gắn 3 Nu chọn lọc ở đầu 3’ và chỉ EcoRI được đánh dấu huỳnh quang ở đầu 5’. Vì vậy những sợi chứa EcoRI được phát hiện trên máy ABI 310. Phản ứng được bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo cho mồi chọn lọc . Nhiệt độ này giảm dần sẽ tăng sự kết hợp. Sử dụng primer gắn với 3 Nu chọn lọc sẽ giúp hạn chế việc bắt cặp sai, chỉ nhân lên một số băng chuyên biệt. Điện di và phân tích kết quả Trong quá trình điện di do có điện tích và khối lượng khác nhau, những phân tử và những hạt trong một hỗn hợp sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và phân tách thành những tiểu phần khác nhau. Những đoạn DNA có kích thước khác nhau cũng sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau trong điện trường,tạo nên những tiểu phần khác nhau. * Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di DNA: - Bản chất và nồng độ gel - Hiệu điện thế và cường độ dòng điện - Quan hệ giữa hiệu điện thế và chiều dài gel: Để tạo ra một điện trường phải có một hiệu điện thế. Hiệu điện thế được tính bằng tích của điện trường với chiều dài phân tách, như vậy, gel càng dài thì hiệu điện thế sử dụng càng phải lớn để tạo một điện trường nhất đinh trên toàn bộ gel. - Nhiệt độ đối với quá trình điện di: Quá trình điện di sẽ sinh ra năng lượng mà hầu hết năng lượng này chuyển thành nhiệt năng,nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phân tách cá DNA trên gel PA biến tính trong khỏang 500C. Nhiệt độ này được điều khiển bằng việc tăng giảm các giá trị hiệu điện thế và công suất điện khi điện di. Phân tích sản phẩm AFLP: Sau khi PCR một thể tích formamide dye được thêm vào phản ứng, mẫu được biến tính bằng nhiệt ở 950C trong 3 phút và đặt ngay vào đá. Sản phẩm của AFLP được điện di trên gel polyaryamide biến tính(19 acryamide: 1 bisacrryamide; 7,5 Murea; 0,5 X TBEbuffer). Bản gel được cố định trong axit axetic 10%, nhuộm trong bạc nitrat 1%, hiện trong natricacbonat 2,5 % và cố định trong axetic 10%. V. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM Ưu điểm Nhanh, đơn giản và không phức tạp như RFLP, nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gene Cần ít lượng DNA ban đầu Không cần biết trước trình tự ban đầu Khuếch đại có chọn lọc( phân tích đa dạng các quần thể có quan hệ gần nhau) Lượng mồi dung ít Là kỹ thuật in dấu DNA hiệu quả Cá thể in dấu DNA của bất kỳ loài nào Nhược điểm Cần kỹ thuật máy tính cao Lệ thuộc vào nhhiều thao tác ở những bước đầu để được phổ diện các phân đoạn DNA lý tưởng AFLP là một marker trội nên khó phân biệt đồng hợp và dị hợp Trong xây dựng bản đồ di truyền, AFLPs thường tâp trung tại vùng centromeres v2 telomeres Nhân viên phải có kỹ thuật phòng thí nghiệm và đặc biệt là phân tích dữ liệu VI. ỨNG DỤNG - Công cụ có hiệu quả phát hiện tính chất đa hình - Xây dựng bản đồ di truyền có mật độ cao của genome - Xây dựng bản đồ DNA marker có hiệu qủa nhất so với những marker khác Khám phá ra những clone của genome, thí dụ YAC - Fingerprinting các đoạn DNA đã được “cloned” như cosmid, P1, BAC, YAC - Quản lý các chất chỉ thị thăm dò VII. KẾT LUẬN Kỹ thuật AFLP dựa vào sự khuếch đại chọn lọc các phân đoạn hạn chế sau khi phân giải DNA Nó thăm dò sự đa hình gây ra bởi nhiều thay đổi trong nhiều điềm hạn chế hay vùng lân cận Kỹ thuật này tạo một lượng lớn bands, đòi hỏi phải có kỹ thuật. VIII.TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu sách: Khuất Hữu Thanh. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Hà Nội,NXB Khoa học kỹ thuật,2009 Lê Đình Lương, Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Hà Nội, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, 2009 Hồ Huỳnh Thùy Dương, sinh học phân tử. Hà Nội, NXBGD 2008 Lê đình Lương, Phan Cự Nhân. Cơ sở di truyền học. Hà Nội, NXBGD 2007 Dương Tấn Nhựt, Bùi Văn Thế Vinh, Trần Trọng Tuấn Kỹ thuật di truyền trong công nghệ chọn tạo giống hoa. Công nghệ sinh học,,2009, số 7(4) Bemard R.Glick, Jack J. Pasternak. Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA. USA, Washington, D.C., ASM Press, 1998 Tài liệu Internet: https://www.youtube.com/watch?v=uNDjLckeAYY https://www.youtube.com/watch?v=uCCbSNIgkrE CÂU HỎI AFLP là gì? sự đa hình các đọan khuếch đại( DNA) sự đa hình các đọan do cắt bởi RE khuếch đại nhanh nhiều bản sao Nguyên tắc của AFLP là gì? Cắt bằng RE và nối bằng ligase => khuếch đại => điện di Cắt bằng RE và nối bằng adaptor=> khuếch đại=> điện di Phân lập DNA => cắt bằng RE và nối bằng adaptor=> khuếch đại => điện di và phân tích kết quả Phân lập DNA => cắt bằng RE và nối bằng ligase => khuếch đại => điện di và phân tích kết quả Trình tự đặc hiệu của enzyme EcoRI và MseI là bao nhiêu cặp nucleotide? 4& 4 4&6 6&4 6&6 Mồi chọn lọc gồm bao nhiêu phần? 1 2 3 4