Luận án Ảnh hưởng của nitrite, nhiệt độ và nồng độ CO2 cao lên các quá trình sinh lý và tăng trưởng của cá thát lát còm (chitala ornata, gray 1831)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã ngành: 9 62 62 03 01 LÊ THỊ HỒNG GẨM ẢNH HƯỞNG CỦA NITRITE, NHIỆT ĐỘ VÀ NỒNG ĐỘ CO2 CAO LÊN CÁC QUÁ TRÌNH SINH LÝ VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala ornata, Gray 1831) Cần Thơ, 2018 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: Gs.Ts. Nguyễn Thanh Phương Người hướng dẫn phụ: PGs.Ts. Mark Bayley Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: .. Vào lúc: .. giờ .. ngày .. tháng .. năm .. Phản biện 1: . Phản biện 2: . Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃCÔNG BỐ 1. Gam, L.T.H., Jensen, F.B., Damsgaard, C., Huong, D.T.T., Phuong, N.T. and Bayley, M., 2017. Extreme nitrite tolerance in the clown knifefish Chitala ornata is linked to up-regulation of methaemoglobin reductase activity. Aquatic Toxicology. 187: 9–17. 2. Gam, L.T.H., Jensen, F.B., Huong, D.T.T., Phuong, N.T., and Bayley, M., 2018. The effects of elevated environmental CO2 on nitrite uptake in the air-breathing clown knifefish, Chitala ornata. Aquatic Toxicology. 196: 124-131. 3. Gam, L.T.H., Vu, N.T.T., Nhu, P.N., Phuong, N.T. and Huong, D.T.T., 2018. Effects of nitrite exposure on haematological parameters and growth in clown knifefish (Chitala ornata, Gray1831). Can Tho University Journal of Science. 54(2): 1-8. 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu là sự thay đổi của khí hậu ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến các hoạt động của con người, thay đổi kết cấu của của khí quyển toàn cầu, và khí hậu tự nhiên qua một thời gian dài (UNFCCC, 1992). Sự thay đổi này xuất phát từ sự tăng các khí độc hại như CO2, N20, CH4, nồng độ khí nhà kính cũng như sự gia tăng nhiệt độ 2.5ºF (1- 4 ºC) trong thế kỷ tiếp theo (IPCC, 2013).Theo đánh giá về mức độ thiệt hại, Việt Nam xếp hạng 27 trong số 132 quốc gia trên thế giới chịu tác động đáng kể của biến đổi khí hậu. Với đặc điểm địa hình và điều kiện địa lý tự nhiên, đồng bằng sông Mê Kông (MD) trở thành một trong số những khu vực chịu tác động nhiều nhất trên thế giới. Sự tăng nhiệt độ làm tăng trao đổi chất của động vật thủy sản và sự phân hủy các hợp chất độc hại. Mặt khác, với sự dày đặc của hệ thống nuôi thâm canh hiện nay, cho ăn quá mức với các sản phẩm thải từ bài tiết của động vật thủy sản đã gây ra khí độc hại như: nitrit, CO2, NH3, H2S... Đặc biệt, nitrit là một sản phẩm của chu kỳ nitơ, được hình thành từ amonia trong điều kiện oxy hòa tan thấp và là độc tố trong hệ thống thủy sản vì nó làm giảm oxy trong máu với sự hình thành methaemoglobin (hiện tượng máu nâu), ảnh hưởng quá trình hô hấp, sinh lý và tăng trưởng (Kroupova và ctv., 2005). Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về ảnh hưởng của các thông số môi trường lên quá trình sinh lý, sinh học trên cá hô hấp khí trời, loài thủy sản chịu ảnh hưởng nghiên trọng bởi tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu với hoạt động hô hấp khí trời. Tính đến thời điểm hiện tại chỉ có hai nghiên cứu về sinh lý trên cá hô hấp khí trời là cá tra (Pangasionadon hypophthalmus) của Lefevre et al., 2011 và cá lóc (Channas striata) của Lefevre et al., 2012 với các kết quả tiêu biểu về khả năng chịu đựng nitrit cao bởi sự giảm hấp thu nitrit qua mang và quá trình nitrat hóa. Ngoài ra, có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường trên cá hô hấp khí trời như nghiên cứu của Damsgaard et al., 2015 về ảnh hưởng của CO2 lên cân bằng acid-base trên cá tra P. hypophthalmus với kết quả là loài này có khả năng điều hòa acid-base hoàn toàn so với các loài hô hấp khí trời khác. Hơn nữa, không chỉ có một độc chất tồn tại trong thủy vực, vì vậy giả định rằng sự kết hợp của các độc chất môi trường sẽ gây ra những ảnh hưởng xấu hơn bởi sự cạnh tranh của chúng đi vào cơ thể cá. Cá thát lát còm C. ornata là loài quan trọng trong nuôi trồng thủy sản ở khu vực Đông Nam Á. C. ornata không chỉ có giá trị thương phẩm cao nhờ hàm lượng protein cao mà còn có giá trị làm cảnh. Luận án này về “Ảnh hưởng của nitrit, nhiệt độ và nồng độ CO2 cao lên các quá trình sinh lý và tăng trưởng của cá thát lát còm (Chitala ornata, Gray 1831)” 2 là vấn đề cấp thiết cần được nghiên cứu để cung cấp kiến thức về ảnh hưởng của ảnh hưởng và cơ chế thích nghi của loài cá này dưới tác động biến đổi khí hậu. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án Mục tiêu của luận án là tìm hiểu ảnh hưởng của nitrit, nồng độ CO2 cao và sự tăng nhiệt độ lên các chỉ tiêu sinh lý máu và tăng trưởng của cá thát lát còm từ sự tiếp xúc bán cấp tính và mãn tính đơn lẻ và kêt hợp của các yếu tố này để cung cấp kiến thức sinh lý chuyên sâu hơn cũng như các đề xuất và giải pháp để hạn chế ảnh hưởng của nitrit và sự kết hợp của nó với thông số môi trường khác trong ao nuôi thủy sản dưới tác động biến đổi khí hậu toàn cầu. 1.3 Các nghiên cứu chính của luận án a) Khảo sát một số yếu tố môi trường trong ao nuôi cá thát lát còm C. ornata b) Xác định giá trị LC50 96 h của nitrite và ảnh hưởng của nitrit lên các thông số sinh lý máu và tăng trưởng của cá thát lát còm C. ornata c) Khảo sát hoạt tính của enzyme metHb reductase khử metHb khi tiếp xúc nồng độ nitrit bán cấp tính trên cá thát lát còm C. ornata d) Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của nitrit và nồng độ CO2 cao lên các thông số sinh lý của cá thát lát còm C. ornata nhỏ và lớn e) Xác định sự chịu đựng nhiệt độ và ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau lên các thông số sinh lý trên cá thát lát còm C. ornata nhỏ và lớn f) Xác định giá trị LC50 96 h của nitrite ở nhiệt độ cao và ảnh hưởng của nitrit ở các nhiệt độ khác nhau lên các thông số sinh lý của cá thát lát còm C. ornata g) Khảo sát ảnh hưởng của nitrit ở các nhiệt độ khác nhau lên các thông số sinh lý, tăng trưởng và hoạt tính enzyme tiêu hóa của cá thát lát còm C. ornata 1.4 Giả thiết nghiên cứu của luận án a) Trong quá trình tiếp xúc nitrit, C. ornata giảm tốc độ trao đổi ion HCO3 - /Cl - và/hay tăng hoạt tính của enzyme NADH metHb reductase khử metHb và chịu sự thay đổi đáng kể của các ion khác để phục hồi sau tiếp xúc b) Sự điều hòa pH khi hô hấp acid dẫn đến sự giảm tốc độ trao đổi ion HCO3 - /Cl - và ức chế sự hấp thu của nitrite c) Sự tiếp xúc nitrit mãn tính dẫn đến các ảnh hưởng tiêu cực đến tăng trưởng như giảm tăng trọng, giảm tỉ lệ sống và hệ số chuyển hóa thức ăn FCR cao. 3 d) Nhiệt độ cao làm mất cân bằng acid-base như sự giảm pH và tăng PCO2, dẫn đến rối loạn các số lượng tế bào máu, nồng độ Hb và ion trong huyết tương. e) C. ornata có sự chịu đựng nitrit thấp hơn ở nhiệt độ cao, dẫn đến những ảnh hưởng đáng kể hơn đến các thông số sinh lý và tăng trưởng so với tiếp xúc nitrit hay nhiệt độ cao riêng lẻ 1.5 Các đóng góp quan trọng và tính ứng dụng của luận án Luận án đã cung cấp kiến thức sinh lý chuyên sâu của cá hô hấp khí trời C. ornata bao gồm những đề xuất và giải pháp hạn chế ảnh hưởng nitrit và sự kết hợp của nó với các yếu tố môi trường trong hoàn cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu. Với khả năng chịu đựng cao với nitrit, nhiệt độ và CO2 khi tiếp xúc bán cấp tính và mãn tính, C. ornata có thể thích nghi với sự thay đổi khắc nghiệt của môi trường như nhiệt độ (từ 24-33ºC), PCO2 (dưới 21 mmHg) và nồng độ nitrit (dưới 2.5 mM) đóng góp sự phát triển bền vững của động vật thủy sản khi nhiệt độ được dự đoán tăng (1- 4ºC) vào thế kỷ tới và sự tích lũy của các khí độc như: nitrit, CO2 trong hệ thống nuôi thâm canh. Các kết quả của luận án sẽ là nền tảng tin cậy để xây dựng các thí nghiệm chuyên sâu hơn sau nay về sinh lý trên C. ornata và các loài cá hô hấp khí trời khác hay so sánh với các phản ứng sinh lý của các loài này với các loài động vật thủy sản khác dưới sự thay đổi của môi trường. 4 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 Nghiên cứu 1: Khả năng chịu đựng nitrit cao của cá thát lát còm Chitala ornata từ sự tăng hoạt tính của enzyme khử methaemoglobin reductase Cá: 8-10 g; 28-31 ± 0,05 g; Hóa chất: NaNO2 (Merck) Xác định giá trị độ độc cấp tính (LC50 96 h) của nitrit: Cá (8-10 g, n=576) được phân bố ngẫu nhiên trong 48 bể và 12 cá/bể. Cá được ngưng cho ăn 2 ngày trước khi tiếp xúc nitrit các nồng độ: 0; 2,6; 3,7; 4,8; 5,9; 7,0; 8,0; 9,1; 10,2; 11,3; 12,4; và 13,5 mM. Thí nghiệm sinh lý tiếp xúc nitrite bán cấp tính: Cá (31,8 ± 1,8 g, n=300) được lấy ngẫu nhiên từ bể thuần dưỡng 1 m3 trong hệ thống tuần hoàn với cá thông số chất lượng nước tối ưu và bố trí vào các bể thí nghiệm 200-L có sẵn sục khí trước khi thí nghiệm bắt đầu. Các nồng độ nitrit bao gồm đối chứng, 1 mM và 2.5 mM, mật độ 100 cá/bể. Nồng độ nitrit trong nước được theo dõi và điều chỉnh bằng cách bổ sung thêm nitrit suốt thí nghiệm để đảm bảo đúng nồng độ thí nghiệm. Mười cá/bể được thu ở các ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7. - Thu mẫu máu: Máu được thu từ phần đuôi cá. Cá được tiếp xúc với nước đá (được xem như gây mê tạm thời) để thu 1 mL máu được rút từ tĩnh mạch đuôi bằng các kim tiêm có tráng heparin (chất chống đông máu). Cá thu máu xong được đánh dấu bằng cách cắt đuôi. Máu được chia ra hai phần. Một nửa để đo trực tiếp các chỉ tiêu như dẫn xuất haemoglobin (Hb), haematocrit (Hct, ratio between volume of red blood cells), MCHC (hàm lượng Hb trung bình, Huong and Tu, 2010), pH ngoại bào, PCO2 và lactate bằng máy iSTAT (i-STAT Corporation, Princeton, USA) với các thẻ xét nghiệm CG4+. Một nửa máu còn lại được ly tâm lấy huyết tương trữ trong tủ -80°C để sau đó phân tích các ion và áp suất thẩm thấu. Các giá trị pH, PCO2 và HCO3 - trong máu được tính theo phương pháp của Boulitier et al., 1985, Cameron, 1971). - Phương pháp phân tích + Dẫn xuất Hb: Nồng độ các dẫn xuất Hb (oxyHb, deoxyHb, metHb, Hb) được tính đường chuẩn quang phổ từ máu của cá thát lát còm theo phương pháp của Jensen (2007), Lefevre et al. (2012) và Hvas et al. (2016). + Các ion trong huyết tương: Huyết tương thu được từ ly tâm máu 6.000 vòng trong 6 phút để đo áp suất thẩm thấu và nồng độ các ion Na + , Cl - , NO2 - , NO3 - và protein. Áp suất thẩm thấu được đo bằng thiết bị Fiske one-ten osmometer (Fiske® Associates, Two Technology Way, Norwood, Massachusetts, USA). Nồng độ Na+ trong huyết tương được đo bằng thiết bị flame photometer (Sherwood Model 420, Sherwood 5 Scientific Ltd., Cambridge, UK). Nồng độ Cl- được đo bằng thiết bị chloride titrator (Sherwood model 926S MK II Chloride analyzer). NO2 - và NO3 - trong huyết tương được đo bằng phương pháp so màu quang phổ qua phản ứng Griess (Miranda, 2001; Jensen, 2007; Lefevre et al., 2011). + Hàm lượng protein trong huyết tương và tổng lượng nước trong cơ thể: Protein trong huyết tương được đo bằng máy so màu quang phổ theo phương pháp Bio-rad protein assay (Bio-Rad Laboratory, Richmond, CA) sử dụng bovine serum albumin làm đường chuẩn (Bradford, 1976). Tổng lượng nước được tính từ khối lượng cá tươi ban đầu và khô. Khối lượng khô được xác định bằng cá tươi đem sấy ở 60ºC cho đến khi đạt khối lượng không đổi (khoảng 4 ngày). Methaemoglobin reductase activity: Cá (28-30 g, n=216) được ngưng cho ăn 2 ngày trước thí nghiệm, sau đó tiếp xúc với các nồng độ nitrit: đối chứng, 1mM và 2.5 mM, mỗi nồng độ lặp lại, 6 bể/nồng độ. Cá được thu mẫu ở các ngày 0, 2 và 6. Mẫu máu được thu mỗi lần là 6 con/bể đối chứng và 3 con/bể có nitrit. Nitrit được kiểm tra và bổ 2 lần mỗi ngày. Máu (1,5 mL) được rút từ mỗi cá nhiễm nitrit, và rửa 4 lần (tương tự như trên cá đối chứng) và pha loãng với dung dịch đệm Ringer để đạt được 3 mL hỗn hợp RBC. Hỗn hợp này cũng được lắc đều trong bình thủy tinh có chưa hỗn hợp 99% không khí và 1% khí CO2 để thu mẫu RBC theo sự giảm của metHB để tính tốc độ enzyme metHb reductase (tương tự như trên cá đối chứng). Xử lý thống kê: Tất cả các hình và biểu bảng được vẽ bằng chương trình Sigma plot 12.5. Tất cả số liệu được phân tích bằng SPSS 18.0. Giá trị trung bình, khoảng trên-dưới (độ tin cậy 95%) của giá trị LC50 96 h của nitrit được phân tích bằng JMP 9.0. Two- way ANOVA (phương pháp so sánh nhiều nhân tố Holm-Sidak) được sử dụng để nhận biết sự khác nhau giữa các nghiệm thức ở cùng thời điểm thu mẫu và giữa các thời gian thu mẫu ở cùng một nghiệm thức cho tất cả các chỉ tiêu sinh lý máu (dẫn xuất Hb, Hct, Hb, MCHC trong máu, NO2 - , NO3 - , ions, protein, áp suất thẩm thấu trong huyết tương và tổng lượng nước trong cơ thể cá. Số liệu được chuyển sang phân phối chuẩn dựa vào Shapiro- Wilk test (chuyển sang dạng logarit). Giá trị p<0.05 được xem là khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trong thí nghiệm hoạt tính của enzyme metHb reductase, logarit của metHb được chuyển sang dạng phương trình hồi quy bậc nhất để tính toán độ dốc của hằng số tốc độ enzyme metHb reductase. 2.2 Nghiên cứu 2: Ảnh hưởng của nitrite lên các chỉ tiêu sinh lý máu và tăng trưởng trên cá thát lát còm (Chitala ornata) Cá: (11,93±0,81 g; 11,53±0,15 g); Hóa chất: NaNO2 (Merck) 6 Ảnh hưởng của nitrite lên các chỉ tiêu sinh lý máu: Cá (11,93±0,81 g, n=800) được ngẫu nhiên lấy từ các bể thuần dưỡng 1 m3 với chất lượng nước tối ưu, và sau đó được phân phối ra 16 bể (500-L) (mỗi bể chứa 500-L và 50 cá/bể). Nước trong các bể được sục khí liên tục trong hai ngày trước thí nghiệm. Từ khả năng chịu đựng nitrite của (96 h LC50 of 7,82 mM nitrite, Gam et al., 2017), thí nghiệm sinh lý được bố trí với 4 nghiệm thức: đối chứng, 0,2 mM (9,2 mg/L), 0,4 mM (18,4 mg/L, 5%*96 h LC50), and 4 mM nitrite (184 mg/L, 50%*96 h LC50), với 4 lần lặp lại (4 bể) cho mỗi nghiệm thức. Nitrite trong nước được theo dõi hai lần mỗi ngày, nitrit cũng được bổ sung hai lần mỗi ngày để duy trì nồng độ nitrit suốt thí nghiệm bằng máy so màu quang phổ (Lefervre et al., 2011; 2012). Ba cá/bể sẽ được thu mẫu máu ở các ngày: 0, 1, 3, 7, và 14. Nước đá được sử dụng để gây mê tạm thời cho việc lấy máu. Một lượng máu 300 µL được lấy từ tĩnh mạch đuôi của cá bởi các kim tiêm được tráng heparin để đo các chỉ tiêu sinh lý máu bao gồm: Hb và metHb (Jensen, 2007; Lefevre et al., 2011, 2012; Hvas et al., 2016; Gam et al., 2018) Ảnh hưởng của nitrit lên tăng trưởng: - Phương pháp: Cá (11,53±0,15 g, n=600) được bắt ngẫu nhiên từ các bể 1 m3, sau đó bố trí ra 12 bể 500-L (300 L nước và 50 cá/bể) với sục khí được chuẩn bị 2 ngày trước thí nghiệm. Thí nghiệm cũng được bố trí với 4 nghiệm thức: đối chứng, 0,2 mM, 0,4 mM, và 4 mM nitrit, với 3 lần lặp lại (3 bể/nghiệm thức) trong 90 ngày nuôi. Nitrit được theo dõi và bổ sung mỗi 3 ngày trước khi thay nước (30%), và sau đó bổ sung để đạt nồng độ nitrit của thí nghiệm. Cá được cho ăn với thức ăn công nghiệp với tốc độ cho ăn (5% khối lượng thân). Độ ẩm của thức ăn (Shrimp feed with 38% protein, Tomboy Aquafeed Company, Vietnam) dưới 10%. Viên thức ăn cùng kích cỡ (1 g = 203 viên). Thức ăn thừa sau 30 phút ăn được vớt ra và tính toán để tìm ra lượng thức ăn cá đã sử dụng. Ba mươi cá/bể được được thu mẫu ở các ngày 0, 30, 60 và 90 để đo các chỉ tiêu tăng trưởng: WG, DWG, SGR, FCR, và SR. Xử lý thống kê: Tương tự nghiên cứu 1. Tuy nhiên, one-way ANOVA được sử dụng để nhận dạng sự khác biệt giữa nghiệm thức đối chứng với các nghiệm thức khác cho các chỉ tiêu tăng trưởng. 2.3 Nghiên cứu 3: Ảnh hưởng của nồng độ CO2 cao lên sự hấp thu nitrit trên cá thát lát còm Chitala ornata Cá: C. ornata (571±56,3 g); Hóa chất: NaNO2, khí CO2 Thuần dưỡng cá: C. ornata từ các trại giống địa phương được vận chuyển về trường Đại học Cần Thơ. Cá được thuần dưỡng trong các trại thực nghiệm 27-28ºC trong các bể 4 m3 có sục khí liên tục (oxy bảo hòa trên 90%) trong hai tuần trước thí nghiệm. Cá được cho ăn với thức 7 ăn công nghiệp (shrimp feed with 38% protein, Tomboy Aquafeed company, Vietnam). Nước trong bể (30%) được thay đổi định kỳ mỗi 2 ngày để đảm bảo chất lượng nước (NO2 - < 1 µM, NO3 - < 40 µM và NH3 < 40 µM). Cá được ngưng cho ăn trước khi bắt đầu thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện dựa trên tiêu chuẩn bảo vệ động vật thí nghiệm của Việt Nam. Tổng số 24 con cá được sử dụng. Đút ống cá: Cá được gây mê với 0.05 g L-1 benzocaine và ống dẫn lưu polyethylene PE40 (Smiths Medical International Ldt., Kent, UK) được chèn vào động mạch lưng của cá xuyên qua phần lưng của miệng cá (Soivio et al., 1975), cùng lúc phần mang cá được cung cấp đầy đủ oxy trong nước có chứa liều nhẹ hơn 0.025 g L-1 benzocaine. Cá được phục hồi sau quá trình đúc ống trong 24 h trước thí nghiệm để không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu máu được lấy sau đó (Phuong et al., 2017a). Thu mẫu máu: Thí nghiệm được bố trí trong bể 500-L tuần hoàn với 6 bể 120-L nhỏ với 1 cá lớn được đúc ống trong mỗi bể. PCO2 được điều khiển bằng máy Oxyguard Pacific system nối với một đầu dò G10ps CO2 và một đầu dò K01svpld pH (Oxyguard International A/S, Farum, Denmark), khí CO2 được cung cấp, pH trong nước sẽ thay đổi theo để đạt đạt giá trị PCO2 trong nước như thí nghiệm bố trí. Có 4 nghiệm thức: (i) Đối chứng (PCO2 < 0.7 mmHg); (ii) CO2 cao (PCO2 = 21 mmHg); (iii) 1 mM nitrit and (iv) thuần trong CO2 cao + 1mM nitrit. Ở nhóm kết hợp này, cá được đúc ống và thuần trong CO2 cao (21 mmHg CO2) in 96 h trước khi bổ sung 1 mM nitrit. Nhiệt độ nước được giữ 27- 28ºC suốt thí nghiệm và PO2 trong nước (120 mmHg). Nitrit được bổ sung bằng NaNO2 và kiểm tra sau mỗi lần thu mẫu. Suốt thí nghiệm, 0,8 mL máu được thu từ các ống dẫn lưu ở các thời điểm: 0, 3, 6, 24, 48, 72 và 96 h. Máu được chia ra làm 2 phần. Một nửa để đo trực tiếp các chỉ tiêu: Hct, pHe, PCO2, và dẫn xuất Hb. Phần máu còn lại được ly tâm lấy huyết tương (6.000 vòng trong 6 phút) và huyết tương được trữ trong tủ âm để phân tích (NO2 - , NO3 - , HCO3 - , Na + , K + , Cl -) và áp suất thẩm thấm. Phân tích mẫu: tương tự phương pháp trong Nghiên cứu 1 Statistics: Tương tự nghiên cứu 1. 2.4 Nghiên cứu 4: Ảnh hưởng kết hơp của nitrite và nồng độ CO2 cao lên các chỉ tiêu sinh lý máu của cá thát lát còm nhỏ (Chitala ornata) Cá: C. ornata giống (30-40 g); Hóa chất: NaNO2, khí CO2 Thuần dưỡng cá và bố trí thí nghiệm: Tương tự nghiên cứu 4, Với kích thước cá nhỏ nên mật độ bố trí và phương pháp lấy máu khác biệt. Mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại (3 bể, 45 cá/bể). 8 Thu mẫu máu: Các mẫu máu (3 con/bể) được thu ở các thời điểm 0, 3, 6, 24, 48, 72 và 96 h. Cá được sử dụng nước đá gây mê tạm thời trước khi rút máu bằng các ống kim tiêm có tráng chất chống đông heparin (400 µL máu/cá) để đo các chỉ tiêu tương tương như Nghiên cứu 3. Phương pháp phân tích: Tương tự phương pháp trong nghiên cứu 1. Xử lý thống kê: Tương tự nghiên cứu 1. 2.5 Nghiên cứu 5: Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau lên các chỉ tiêu sinh lý máu của cá thát lát còm (Chitala ornata) Cá: (8-10 g, 29.2±3.4 g, 521 ± 32g); Vật liệu: heaters, coolers Xác định ngưỡng nhiệt độ của C. ornata: Mười hai cá (8-10 g) được bố trí trong các xô nhựa (30-L nước mỗi xô). Thí nghiệm gồm hai 2 nhóm: ngưỡng trên-tăng nhiệt và ngưỡng dưới-giảm nhiệt với 6 lần lặp lại mỗi nhóm. Nhiệt độ ban đầu là 27ºC; sau đó được tăng hoặc giảm ở các xô (1ºC mỗi giờ) bằng nước ấm, sau đó sử dụng heater để giữ nhiệt độ thí nghiệm; hay sử dụng nước đá, sau đó sử dụng cooler để giữ nhiệt độ thí nghiệm. Cá được theo dõi các hoạt động bơi lội đến khi đạt 50% tỉ lệ chết (cá không di chuyển, mang không hoạt động). Khi đó, ngưỡng nhiệt độ được xác định. Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau lên các chỉ tiêu sinh lý máu trên C. ornata kích thước nhỏ: Cá (n=575, 29,2±3,4 g) được bắt từ bể chứa 1 m 3 trong hệ thống tuần hoàn, sau đó bố trí vào các bể nhỏ 200-L với sục khí liên tục. Cá