Luận án Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHƯU MỸ LỆ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHƯU MỸ LỆ KHƯU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế Mã số: 62720402 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. HOÀNG MINH CHÂU 2. GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Khưu Mỹ Lệ MỤC LỤC ............................................................................................................................ Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt, bảng đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt Danh mục các bảng, hình, biểu đồ và sơ đồ MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 1.1. Tình hình nghiên cứu và thành tựu của công nghệ nano ..................................... 4 1.2. Khái niệm và phân loại tiểu phân nano trong ngành dược .................................. 7 1.3. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid ..................................................... 9 1.4. Phương pháp phân tích tính chất của hệ tiểu phân nano lipid ............................... 16 1.5. Các tá dược dùng trong bào chế hệ tiểu phân nano ART .................................. 25 1.6. Artemisinin và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị sốt rét ................................ 27 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 39 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 59 3.1. Kết quả đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol 888® ATO – LabrafacTM PG) và ART ........................................................................................... 59 3.2. Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART ...... 65 3.3. Kết quả đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART ..................................... 92 3.4. Kết quả đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm P. berghei ............................................................................. 122 Chương 4. BÀN LUẬN .........................................................................................127 4.1. Tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) và ART ................................................................................................................................. 127 4.2. Công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART ................................. 128 4.3. Tính chất của hệ tiểu phân nano ART .............................................................. 136 4.4. Tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei..................................................................................... 142 KẾT LUẬN ............................................................................................................144 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFM Atomic force microscopy ART Artemisinin ACTs Artemisinin – based combination therapies ARTs Artemisinin and its derivatives CT Công thức DĐ Dược điển DHA Dihydroartemisinin DM Dung môi D/N Dầu/Nước DSC Differential scanning calorimetry HPH High pressure homogenization HPLC High performance liquid chromatography HSNH Hiệu suất nang hóa KHV Kính hiển vi KT Kết tủa KST Ký sinh trùng KTTP Kích thước tiểu phân LD Laser diffraction N/D Nước/Dầu N/D/N Nước/Dầu/Nước NLC Nanostructured lipid carriers NT Nhũ tương PCS Photon correlation spectroscopy PD Pha dầu PdI Poly dispersity index PEG Polyethylen glycol PN Pha nước PTHC Phóng thích hoạt chất PTNH Phần trăm nang hóa RESS Rapid expansion from supercritical solutions RH Relative humidity SAS Supercritical antisolvent SEM Scanning electron microscopy SLN Solid lipid nanoparticles STH Siêu tới hạn TB Trung bình TEM Transmission electron microscope TN Thí nghiệm BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT Artemisinin and its derivatives Artemisinin và dẫn chất Artemisinin – based combination therapies Các liệu pháp phối hợp dựa vào artemisinin Atomic force microscopy Phép đo kính hiển vi lực nguyên tử Differential scanning calorimetry Phép đo quét nhiệt vi sai High pressure homogenization Đồng nhất hóa áp suất cao High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao Laser diffraction Nhiễu xạ laser Nanostructured lipid carriers Giá mang lipid cấu trúc nano Photon correlation spectroscopy Phổ tương quan photon Poly dispersity index Chỉ số đa phân tán Rapid expansion from supercritical solutions Khuếch trương nhanh từ dung dịch siêu tới hạn Relative humidity Độ ẩm tương đối Scanning electron microscopy Phép đo kính hiển vi điện tử quét Solid lipid nanoparticles Tiểu phân nano lipid rắn Supercritical antisolvent Đối kháng dung môi siêu tới hạn Transmission electron microscopy Phép đo kính hiển vi điện tử truyền qua DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Số lượng công bố về vật liệu nano ở một số nước ASEAN và Nhật .......... 5 Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc nano đang lưu hành trên thị trường ....................... 6 Bảng 1.3 Một số lipid lớp đơn và dầu dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid ...... 10 Bảng 1.4 Ưu nhược điểm của các phương pháp bào chế tiểu phân nano ................. 15 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 37 Bảng 2.2 Hóa chất và dung môi nghiên cứu ............................................................. 37 Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................... 38 Bảng 2.4 Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano ART ................................ 42 Bảng 2.5 Các mức của yếu tố khảo sát ..................................................................... 46 Bảng 3.1 Thể chất của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG ................. 59 Bảng 3.2 Nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG và lượng ART khác nhau .......................................................................................... 64 Bảng 3.3 Thành phần các công thức bào chế hệ tiểu phân nano .............................. 65 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát một số tính chất của hệ tiểu phân nano .......................... 65 Bảng 3.5 Thông số KTTP của CT 6 .......................................................................... 68 Bảng 3.6 Thành phần công thức với chất diện hoạt polysorbat 80 ........................... 69 Bảng 3.7 Thông số KTTP của mẫu 25, 26 và 27 ...................................................... 69 Bảng 3.8 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – Gelucire® 50/13 ......................................................................................................... 71 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá một số tính chất của mẫu 19, 20 và 21 .......................... 71 Bảng 3.10 Thông số KTTP của mẫu 19, 20 và 21 .................................................... 71 Bảng 3.11 Thành phần công thức với hỗn hợp polysorbat 80 - phosphatidylcholin .................................................................................................................................. .73 Bảng 3.12 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 22, 23 và 24 .......................... 73 Bảng 3.13 Thông số KTTP của CT 22, 23 và 24 ...................................................... 75 Bảng 3.14 Thành phần các công thức phối hợp phosphatidylcholin ........................ 75 Bảng 3.15 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 16, 17 và 18 .......................... 76 Bảng 3.16 Thông số KTTP của CT 17 và 18 ............................................................ 77 Bảng 3.17 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – SimulsolTM 4000 P .................................................................................................... 78 Bảng 3.18 Thông số KTTP của CT 28, 29 và 30 ...................................................... 80 Bảng 3.19 Thông số KTTP của mẫu đồng nhất hóa bằng HPH ............................... 82 Bảng 3.20 Thông số KTTP của mẫu sau khi tăng áp suất đồng nhất hóa ................ 84 Bảng 3.21 Tính chất của các hệ tiểu phân có hàm lượng ART khác nhau ............... 85 Bảng 3.22 Các mức của yếu tố khảo sát ................................................................... 87 Bảng 3.23 Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả ....................................................... 87 Bảng 3.24 KTTP của 6 TN ở điều kiện cơ bản ......................................................... 88 Bảng 3.25 Kích thước tiểu phân TB của thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng .......... 89 Bảng 3.26 Thông số KTTP của các lô kiểm chứng .................................................. 90 Bảng 3.27 Sự thay đổi KTTP trong quá trình khảo sát ............................................. 91 Bảng 3.28 Thông số kích thước của hệ tiểu phân nano ART ................................... 92 Bảng 3.29 Các thông số sắc ký của thẩm định tính tuyến tính ................................. 97 Bảng 3.30 Các thông số thẩm định độ lặp lại ........................................................... 98 Bảng 3.31 Các thông số sắc ký của ART .................................................................. 99 Bảng 3.32 Các thông số thẩm định độ đúng ............................................................. 99 Bảng 3.33 Hàm lượng % và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART ........ 100 Bảng 3.34 Dữ liệu lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART ........ 101 Bảng 3.35 Thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART ........................ 102 Bảng 3.36 Tiêu chuẩn nguyên liệu của công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART ................................................................................................................................. 103 Bảng 3.37 Chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân nano ART ................................... 103 Bảng 3.38 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano ART các lô nâng cấp .............. 109 Bảng 3.39 Hàm lượng %, PTNH và HSNH của lô nâng cấp.................................. 111 Bảng 3.40 Lượng hoạt chất phóng thích của lô nâng cấp ....................................... 112 Bảng 3.41 Tính chất của hệ tiểu phân lô nâng cấp ................................................. 113 Bảng 3.42 Bảng tóm tắt tính chất của tiểu phân lô tối ưu, kiểm chứng và nâng cấp ................................................................................................................................. 113 Bảng 3.43 Kết quả tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano không chứa ART ... 114 Bảng 3.44 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART ở 6 ± 2 oC ... 115 Bảng 3.45 Giá trị p so sánh KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART theo thời gian bảo quản với tháng 0 ....................................................................................... 115 Bảng 3.46 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC .................. 116 Bảng 3.47 Giá trị p so sánh KTTB của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC............ 116 Bảng 3.48 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC ....................... 117 Bảng 3.49 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH . 119 Bảng 3.50 Giá trị p so sánh kích thước của hệ tiểu phân nano ART theo thời gian bảo quản với tháng 0 ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH..................................................... 119 Bảng 3.51 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH ................................................................................................................................. 120 Bảng 3.52 Mật độ KST (KST/vi trường) của lô chứng âm và các lô điều trị ......... 122 Bảng 3.53 Giá trị p đánh giá mật độ KST giữa lô chứng âm và lô điều trị ............ 123 Bảng 3.54 Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột giữa lô chứng âm và lô điều trị ................................................................................................................................. 124 Bảng 3.55 Thời gian sống sót của chuột lô chứng âm và các lô điều trị (ngày 35) ................................................................................................................................ .125 Bảng 3.56 Thời gian sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị (ngày 35) ........ 125 Bảng 3.57 Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị (ngày 35) ................................................................................................................. 126 Bảng 4.1 Kích thước của tiểu phân nano ART ở các áp suất và chu kỳ khác nhau ................................................................................................................................ .135 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Tỉ lệ bằng sáng chế trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe của một số quốc gia trên thế giới (a) và tỉ lệ bằng sáng chế trong các lĩnh vực ứng dụng (b) .................... 5 Hình 1.2 Cấu tạo SLN (a), NLC dạng I (b), NLC dạng II (c) và NLC dạng III (d) ... 9 Hình 1.3 Hình minh họa cấu tạo (a) và cơ chế hoạt động (b) của máy HPH ........... 13 Hình 1.4 Các phương pháp đo kích thước và vùng kích thước phù hợp .................. 17 Hình 1.5 Vị trí định vị hoạt chất nang hóa ở tiểu phân ............................................. 22 Hình 1.6 Hình minh họa sự giải phóng hoạt chất qua túi thẩm tách ......................... 24 Hình 1.7 Hình minh họa tế bào Franz ....................................................................... 24 Hình 1.8 Công thức hóa học của artemisinin ............................................................ 27 Hình 3.1 Hình ảnh tiểu phân của CT 13 quan sát bằng KHV (x 100) ...................... 66 Hình 3.2 Hình ảnh tiểu phân của CT 12 quan sát bằng KHV (x 100) ...................... 66 Hình 3.3 Hình ảnh tiểu phân của CT 9 quan sát bằng KHV (x 100) ........................ 67 Hình 3.4 Hình ảnh tiểu phân của CT 6 quan sát bằng KHV (x 100) ........................ 67 Hình 3.5 Hình ảnh tiểu phân nano ART chụp bằng TEM (x 50.000) ....................... 94 Hình 3.6 Hình ảnh tiểu phân của lô nâng cấp chụp bằng TEM (x 30.000) ............ 110 Hình 3.7 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 3 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 50.000) ................................................................................................................................. 118 Hình 3.8 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 6 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 30.000) ................................................................................................................................. 118 Hình 3.9 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 4 tháng bảo quản ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH (x 30.000) .......................................................................................................... 121 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Biểu đồ nhiệt (a) Compritol® 888 ATO, (b) hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) ................................................................................... 60 Biểu đồ 3.2 Biểu đồ điểm chảy của Compritol® 888 ATO và các hỗn hợp lipid ..... 61 Biểu đồ 3.3 Biểu đồ nhiệt của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART 62 Biểu đồ 3.4 Biểu đồ nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG và lượng ART khác nhau ................................................................. 63 Biểu đồ 3.5 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 6......................................... 68 Biểu đồ 3.6 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 25 (a), 27 (b) và 26 (c) ...... 70 Biểu đồ 3.7 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân CT 20 (a), CT 21 (b) và 19 (c)....... 72 Biểu đồ 3.8 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân CT 22 (a), 24 (b) và 23 (c) ............. 74 Biểu đồ 3.9 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 18 (a) và 17 (b) .................. 76 Biểu đồ 3.10 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 30 (a), 28 (b) và 29 (c) .... 79 Biểu đồ 3.11 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của mẫu HPH 500 bar 10 chu kỳ 81 Biểu đồ 3.12 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân sau HPH 800 bar 10 chu kỳ (a), 1.000 bar 10 chu kỳ (b) và 1.100 bar 5 chu kỳ (c) .................................................... 83 Biểu đồ 3.13 Biểu đồ hiệu suất nang hóa của các hệ tiểu phân nano ART .............. 86 Biểu đồ 3.14 Biểu đồ so sánh các thông số KTTP của các mẫu khảo sát ................. 91 Biểu đồ 3.15 Biểu đồ phân bố kích cỡ của hệ tiểu phân nano ART ......................... 93 Biểu đồ 3.16 Biểu đồ phân bố thế zêta của hệ tiểu phân nano ART ........................ 94 Biểu đồ 3.17 Sắc ký đồ HPLC của ART (a) mẫu chuẩn và (b) mẫu thử .................. 95 Biểu đồ 3.18 Sắc ký đồ (a) pha động (b) mẫu bào chế không chứa ART (c) mẫu chứa ART và (d) mẫu không chứa ART thêm chuẩn ............................................... 96 Biểu đồ 3.19 Đồ thị biểu thị tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh ................. 97 Biểu đồ 3.20 Lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART ................ 101 Biểu đồ 3.21 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của lô nâng cấp .......................... 108 Biểu đồ 3.22 Biểu đồ phân bố thế zêta của lô nâng cấp ......................................... 110 Biểu đồ 3.23 Lượng hoạt chất phóng thích của tiểu phân nano ART lô nâng cấp . 112 Biểu đồ 3.24 Biểu đồ lượng hoạt chất phóng thích lô tối ưu, kiểm chứng và nâng cấp .. 114 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1 Sơ đồ các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano .................................. 11 Sơ đồ 1.2 Các phương pháp xác định kích thước tiểu phân ..................................... 16 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bước bào chế hệ tiểu phân nano ART ...................................... 45 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART .................................... 106 1 MỞ ĐẦU Trong vài thập kỉ gần đây, công nghệ nano đã, đang phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau. Công nghệ nano tạo nên các tiểu phân hoặc cấu trúc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Tuy nhiên, trong dược phẩm, tiểu phân nano bao gồm cả những tiểu phân có kích thước từ 1 nm đến 1 µm được ứng dụng để chuyển giao hoạt chất đến nơi tác động [147]. Với cấu trúc được thiết kế đặc biệt, tiểu phân nano có ưu điểm nổi trội như bảo vệ hoạt chất, tăng tính thấm thuốc qua hàng rào sinh học, giải phóng hoạt chất có kiểm soát, phóng thích tại đích và bảo vệ mô lành, tránh sự đa đề kháng thuốc. Hoạt chất được nghiên cứu thuộc nhiều nhóm