Luận án Chọn tạo các dòng đậu xanh (vigna radiata l.) bằng đột biến ems trên hai giống Đx208 và tai chung

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP TRẦN THỊ THANH THỦY CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU XANH (Vigna radiata L.) BẰNG ĐỘT BIẾN EMS TRÊN HAI GIỐNG ĐX208 VÀ TAICHUNG LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ NGÀNH 9620110 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP TRẦN THỊ THANH THỦY CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU XANH (Vigna radiata L.) BẰNG ĐỘT BIẾN EMS TRÊN HAI GIỐNG ĐX208 VÀ TAICHUNG LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ NGÀNH 9620110 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN 2019 i LỜI CẢM TẠ Trong quá trình thực hiện luận án “Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung” tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô cùng bạn bè đồng nghiệp. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng đến PGs.TS. Trương Trọng Ngôn, thầy đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện cũng như hoàn chỉnh luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Phước Đằng, thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận án. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại học, Quý thầy cô Bộ môn Di truyền và Chọn giống Cây trồng, Bộ môn Khoa học Cây trồng, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt công trình nghiên cứu này. Ngoài ra, tôi cũng không quên gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Huỳnh Kỳ - Trưởng Phòng Thí nghiệm Di truyền Chọn giống, ThS. Nguyễn Châu Thanh Tùng - Trưởng Phòng thí nghiệm Chọn giống và Ứng dụng Công nghệ Sinh học đã cung cấp nhiều kiến thức bổ ích, để tôi có thể thực hiện quá trình SSR-PCR, cũng như trong việc thiết kế mồi giải trình tự gen. Em Lâm Thị Trúc Linh, Trần Thanh Cao, Nguyễn Thị Diễm, Đặng Thị Xuân, Nguyễn Hoàng Tính, Văn Quốc Giang và các em sinh viên thực tập tốt nghiệp ngành Nông học và chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng từ khóa 35 đến khóa 40 đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm. Sau cùng là lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn động viên khích lệ, tạo điều kiện về thời gian và công sức để tôi hoàn thành tốt luận án tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 24 tháng 04 năm 2019 Tác giả Trần Thị Thanh Thủy ii TÓM TẮT Chọn tạo giống đậu xanh bằng phương pháp đột biến bởi hóa chất Ethyl Methane Sulphonate đã được áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới. Việc lựa chọn và phát triển các đột biến thành các giống triển vọng được đề xuất cho nông dân đã được thực hiện thành công trên nhiều quốc gia, tuy nhiên ở Việt Nam vẫn còn ít thông tin. Nghiên cứu được thực hiện nhằm tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn giống đậu xanh và chọn được từ 2 đến 4 dòng đậu xanh đột biến ngắn ngày, năng suất cao, trái chín đồng loạt ở M6. Luận án được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017 tại Trường Đại học Cần Thơ và Công ty Sinh Hóa Phù Sa. Các thí nghiệm ngoài đồng (M2-M6) được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 3 lần lặp lại, khoảng cách gieo 45x20 cm, 2 cây/hốc, sử dụng công thức phân 60N-60P2O5-40K2O. Nội dung nghiên cứu bao gồm (i) Gây tạo đột biến bởi ethyl methane sulphonate (EMS) lên giống ĐX208 và Taichung; (ii) Xác định hiệu quả, hiệu suất đột biến ở M1; (iii) Đánh giá các biến dị hình thái, nông học và chọn dòng đột biến tốt ở M2, M3; (iv) Khảo nghiệm sơ khởi năng suất 32 dòng đậu xanh đột biến ở M4, M5; (v) Khảo nghiệm năng suất, thành phần năng suất và kiểu chín đồng loạt của 33 dòng đậu xanh đột biến ở M6; (vi) Phân tích gen liên quan đến tính trạng khối lượng 1.000 hạt và ngày trổ hoa của các dòng đột biến ở M6 bằng dấu SSR và dấu SNPs. Kết quả đã (1) tạo được nguồn vật liệu đột biến có tiềm năng năng suất cao; (2) Chọn được 11 dòng đậu xanh đột biến ở M6 (ĐX8-1-28-8B, ĐX6-5-1-10, ĐX4A-3-3-1, ĐX2-1-26-5, TC8-4-3-5B, TC8-1-20-3, TC6-6-15-8, TC6-6-24-4, TC6-3-13-8, TC4-6-10-1, TC4-1-12-10). Các dòng này có thời gian sinh trưởng ngắn (56-62 ngày), trái chín đồng loạt, năng suất cao (2,99 – 3,39 tấn/ha); (3) Ba mươi ba dòng đột biến ở M6 đều mang kiểu gen đồng hợp và kiểu gen giữa các dòng đột biến này đã thay đổi so với giống gốc (ĐX208, Taichung tương ứng) ở tính trạng khối lượng 1.000 hạt và ngày trổ hoa; (4) Trình tự gen giữa 6 dòng đậu xanh đột biến và 2 giống gốc đều khác nhau, dòng ĐX8-1-28-8B, ĐX6-6-28- 14, TC8-4-3-5B và TC2-1-33-11 khác biệt về mặt di truyền nhất so với giống ĐX208 và Taichung tương ứng; (5) Số trái trên cây, năng suất hạt/cây (g) và chiều cao cây (cm) ở M3 được kiểm soát bởi gen cộng tính, do đó có thể áp dụng bất kỳ phương pháp chọn lọc nào cũng có thể cải thiện được các tính trạng này; (6) Xử lý EMS ở nồng độ 0,2% EMS cho hiệu quả gây đột biến cao ở cả 2 giống ĐX208 và Taichung. Tuy nhiên, hiệu suất gây đột biến cao trên giống ĐX208 là 0,4% EMS và ở nồng độ 0,8% EMS ở giống Taichung. Từ khóa: hình thái học, đậu xanh, đột biến, quần thể, chín đồng loạt iii ABSTRACT Breeding mungbean variety by Ethyl Methane Sulphonate (EMS) induced mutation has been doing research over the world. Selection and development mutants for new variety were proposed and sucessful in many countries; however, there is few this information in Viet Nam. This study was conducted with the aim to make the material source for the mungbean improvement and to breed from 2 to 4 mutant mungbean lines with short maturity duration, high yielding and synchronous pod maturity. The dissertation was carried out from 2013 to 2017 at Can Tho University and Phu Sa Biotech Company. The experiments in the field from M2-M6 were arranged in a randomized complete block design (RCBD), one factor, 3 replications, spacing of 45x20 cm, 2 plants per hill. The applied fertilizer was 60N-60P2O5-40K2O. The researches contents include (i) inducing mutations by EMS on two DX208 and Taichung varieties; (ii) Determining of mutagenic effectiveness and efficiency in M1 populations; (iii) Evaluating morphological and agronomic traits variations, selecting good mutant lines in M2 and M3; (iv) Preliminary seed yield trial of 32 selected mungbean lines in M4, M5 generations; (v) Assay of seed yield, yield components and synchronous pod maturity in 33 mungbean mutant lines at M6 generation; (vi) Genotyping analysis related to 1,000-seed weight and flowering dates of the elite mutant lines in M6 generation by Simple Sequence Repeat (SSR) and Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) markers. The results revealed that (i) a mutant source of precious materials with high yield potential was created; (2) there were 11 selected mutant mungbean lines in M6 (DX8-1-28-8B, DX6-5-1-10, DX4A-3-3-1, DX2-4-2-5, TC8-4-3-3, TC6-1-20-3, TC6-6-15-8, TC6-6-24-4, TC6-3-13-8, TC4 -6-10-1, TC4-1-12-10) with a short days to maturity (56-62 days), synchronous pod maturity, high yield (2.99 - 3.39 ton ha-1); (3) Thirty-three mutant mungbean lines in M6 are homozygous lines and the genotypes of these mutant lines have changed from the original varieties (DX208, Taichung); (4) It was determined that the gene sequencing of the 6 mutant mungbean lines differing from those of the original varieties, respectively; of which the DX8-1-28-8B, DX6-6-28-14, TC8-4-3-5B and TC2-1-33-11 lines have the most genetic differences; (5) The number of pods per plant, the seed yield per plant (g) and the plant height (cm) in M3 are controlled by the additive genes, therefore, these selective methods can be applie; (6) A concentration of 0.2% EMS resulted in high mutagenic effectiveness in the DX208 and Taichung varieties. However, the high mutagenic efficiency of the DX208 variety was 0.4% EMS and 0.8% EMS Taichung variety. Keywords: morphology, mungbean, mutan, population, synchrony iv CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Trọng Ngôn. Các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Ngày 24 tháng 04 năm 2019 Ngƣời hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh Trần Thị Thanh Thủy v MỤC LỤC Lời cảm tạ ........................................................................................................... i Tóm tắt ............................................................................................................... ii Abstract ............................................................................................................. iii Mục lục .............................................................................................................. v Danh sách bảng .................................................................................................. x Danh sách hình ............................................................................................... xiii Danh mục từ viết tắt ........................................................................................ xv Chƣơng 1: Giới thiệu ....................................................................................... 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 2 1.2.1 Mục tiêu ............................................................................................ 2 1.2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 3 1.4 Thời gian thực hiện ...................................................................................... 4 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .................................................. 4 1.5.1 Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 4 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................. 4 1.6 Những điểm mới của luận án ....................................................................... 4 Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu ......................................................................... 6 2.1 Nguồn gốc, phân loại và bộ gen cây đậu xanh ............................................ 6 2.1.1 Nguồn gốc ......................................................................................... 6 2.1.2 Phân loại thực vật ............................................................................. 6 2.1.3 Bộ gen cây đậu xanh ......................................................................... 6 2.2 Đặc điểm nông học của cây đậu xanh ......................................................... 7 2.2.1 Hệ rễ .................................................................................................. 7 2.2.2 Thân và cành ..................................................................................... 7 2.2.3 Lá ...................................................................................................... 7 vi 2.2.4 Hoa .................................................................................................... 8 2.2.5 Trái .................................................................................................... 8 2.2.6 Hạt ..................................................................................................... 9 2.3 Sâu và bệnh gây hại trên đậu xanh .............................................................. 9 2.4 Thời gian sinh trưởng và mùa vụ canh tác ................................................ 10 2.4.1 Thời gian sinh trưởng ..................................................................... 10 2.4.2 Mùa vụ canh tác .............................................................................. 11 2.5 Tình hình sản xuất và nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ..................... 11 2.5.1 Vai trò của giống và việc cải thiện giống ........................................ 11 2.5.2 Trên thế giới .................................................................................... 11 2.5.3 Ở Việt Nam ..................................................................................... 13 2.6 Ý nghĩa của đột biến cảm ứng trong chọn tạo giống cây trồng ................. 15 2.7 Cơ sở khoa học và vai trò của chọn giống đột biến cảm ứng .................... 16 2.7.1 Cơ sở khoa học của chọn giống đột biến cảm ứng ......................... 16 2.7.2 Vai trò của đột biến cảm ứng .................................................................. 16 2.7.3 Mục tiêu của phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng ............. 17 2.8 Cơ sở di truyền của đột biến ...................................................................... 18 2.9 Các tác nhân gây đột biến .......................................................................... 19 2.9.1 Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ ................................... 20 2.9.2 Cơ chế gây đột biến của tác nhân hóa học ..................................... 21 2.9.3 Cơ chế tác động của Ethyl Methane Sulphonate ............................ 22 2.10 Sự biểu hiện của các kiểu đột biến .......................................................... 24 2.10.1 Các loại đột biến ........................................................................... 24 2.10.2 Những biểu hiện của đột biến ....................................................... 24 2.11 Quá trình phát sinh đột biến và cách nghiên cứu chúng .......................... 24 2.11.1 Chuẩn bị vật liệu đối với cây sinh sản bằng hạt ........................... 24 2.11.2 Chọn tác nhân gây đột biến và liều lượng xử lý ........................... 25 2.11.3 Theo dõi và chọn lọc đột biến ....................................................... 26 2.12 Các biểu hiện hình thái ở cây đột biến .................................................... 32 vii 2.12.1 Đột biến liên quan đến diệp lục .................................................... 32 2.12.2 Đột biến về hình dạng và kích thước lá ........................................ 35 2.12.3 Đột biến về hoa ............................................................................. 35 2.12.4 Đột biến dạng trái ......................................................................... 36 2.12.5 Đột biến về đặc tính trổ hoa sớm và trổ hoa muộn ....................... 37 2.12.6 Đột biến đặc tính chín sớm và chín muộn .................................... 37 2.13 Tình hình phát triển giống cây trồng đột biến ......................................... 38 2.14 Hệ số di truyền và hệ số phương sai ........................................................ 40 2.15 So sánh kiểu gen của dòng đột biến và giống gốc ................................... 42 2.16 Các nghiên cứu về tạo giống cây trồng bằng xử lý EMS ........................ 42 2.16.1 Trên thế giới .................................................................................. 42 2.16.2 Ở Việt Nam ................................................................................... 44 2.17 Giải trình tự DNA và kỹ thuật SSR ......................................................... 45 2.17.1 Giải trình tự DNA ......................................................................... 45 2.17.2 Kỹ thuật SSR ........................................................................ 45 Chƣơng 3: Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ...................... 47 3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................ 47 3.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 47 3.2.1 Vật liệu ............................................................................................ 47 3.2.2 Thiết bị vật tư và hóa chất .............................................................. 48 3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu....................................................... 51 3.3.1 Gây tạo đột biến bằng hóa chất EMS ............................................. 51 3.3.2 Nghiên cứu các quần thể đậu xanh đột biến ở thế hệ M1 ............... 51 3.3.3 Khảo sát các quần thể đậu xanh đột biến ở thế hệ M2 và M3 ......... 52 3.3.4 Khảo nghiệm các dòng đậu xanh đột biến từ M4 đến M5 ............... 53 3.3.5 Khảo nghiệm các dòng đậu xanh đột biến ở thế hệ M6 .................. 53 3.3.6 Kỹ thuật canh tác ............................................................................ 54 3.3.7 Phương pháp thu thập các chỉ tiêu ngoài đồng ............................... 54 3.3.8 Phương pháp ước lược các thông số biến dị di truyền ................... 58 viii 3.3.9 Đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh và đổ ngã .................................. 60 3.3.10 Phương pháp dấu phân tử ở thế hệ M6 ......................................... 61 3.3.11 Phương pháp đánh giá độ thuần ................................................... 65 3.3.12 Phân tích khoảng cách di truyền ................................................... 66 3.3.13 Phương pháp tính chỉ số Pi và chỉ số Theta .................................. 66 3.4 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 67 Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận .................................................................. 68 4.1 Ghi nhận tổng quát..................................................................................... 68 4.2 Sức sống của các quần thể đậu xanh ở M1, vụ Thu Đông 2013 ................ 69 4.2.1 Tỉ lệ sống ở các quần thể đậu xanh ở thời điểm 15 NSKG ............ 70 4.2.2 Tỉ lệ sống của cây lúc trổ ................................................................ 70 4.2.3 Tỉ lệ gây chết so với đối chứng ....................................................... 71 4.3 Hiệu quả và hiệu suất đột biến ................................................................... 72 4.3.1 Tần số đột biến ................................................................................ 72 4.3.2 Hiệu quả đột biến (Mutagenic Effectiveness) ................................ 72 4.3.3 Hiệu suất đột biến (Mutagenic Efficiency) ..................................... 73 4.4 Kết quả nghiên cứu các quần thể đậu xanh từ M1 đến M3 ........................ 73 4.4.1 Đặc tính sinh trưởng của các quần thể đậu xanh từ M1 đến M3 ............. 73 4.4.2 Biến dị hình thái lá ở các quần thể đậu xanh đột biến từ M1-M3 ... 75 4.4.3 Đặc tính nông học của các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và M3 ..... 81 4.5 Nhận xét về kết quả nghiên cứu các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và M3 . 89 4.6 Ước lược thông số di truyền các quần thể đậu xanh ở M3 ........................ 89 4.7 Kết quả khảo sát các đặc tính sinh trưởng, hình thái và nông học ở các dòng đột biến ở M4, M5 và M6 ......................................................................... 93 4.7.1 Đặc tính sinh trưởng của các giống/dòng đậu xanh ở M4 – M6 ...... 94 4.7.2 Đặc tính hình thái của các giống/dòng đậu xanh ở M4 – M6 .......... 99 4.7.3 Đặc tính nông học ở các giống/dòng đậu xanh từ M4 đến M6 ...... 101 4.7.4 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu xanh từ thế hệ M4 đến M6 ................................................................................... 112 ix 4.8 Phân tích kiểu gen bằng dấu SSR ............................................................ 120 4.8.1 Kết quả ly trích và kiểm tra DNA từ lá đậu xanh ......................... 120 4.8.2 Kết quả kiểm tra kiểu gen của các dòng đậu xanh đột biến ......... 124 4.8.3 Mối quan hệ di truyền giữa các giống/dòng đậu xanh dựa trên phân tích SSR ..................................