Luận án Khảo sát đột biến precore và basal core promoter ở bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ CẨM HƯỜNG KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN PRECORE VÀ BASAL CORE PROMOTER Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ CẨM HƯỜNG KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN PRECORE VÀ BASAL CORE PROMOTER Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN CHUYÊN NGÀNH: TRUYỀN NHIỄM VÀ CÁC BỆNH NHIỆT ĐỚI Mã số: 62 72 38 02 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. PHẠM THỊ LỆ HOA 2. PGS.TS. CAO NGỌC NGA TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Nguyễn Thị Cẩm Hường ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục đối chiếu thuật ngữ Anh - Việt vi Danh mục các bảng viii Danh mục các hình x Danh mục các biểu đồ, sơ đồ xi MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 4 1.1. Đặc điểm dịch tễ học nhiễm HBV ......................................................... 4 1.2. Bốn giai đoạn diễn tiến tự nhiên của nhiễm HBV mạn .......................... 9 1.3. Cấu trúc hình thái và bộ gen của HBV ................................................... 13 1.4. Các kỹ thuật chẩn đoán đột biến vùng Precore và Basal core Promoter.. 17 1.5. Đột biến Precore và đột biến Basal core promoter ................................ 21 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 33 2.1. Thiết kế ................................................................................................... 2.2. Dân số đích ............................................................................................. 33 33 2.3. Dân số chọn mẫu .................................................................................... 33 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................... 33 2.5. Cỡ mẫu ................................................................................................... 33 2.6. Tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ ........................................................... 35 2.7. Biến số nghiên cứu ................................................................................ 36 2.8. Định nghĩa biến số chính dùng trong nghiên cứu ................................... 37 2.9. Kỹ thuật đo lường biến số ...................................................................... 39 2.10. Thu thập và phân tích số liệu ................................................................ 2.11. Vấn đề y đức ........................................................................................ 42 43 Chương 3. KẾT QUẢ .................................................................................. 46 3.1. Đặc điểm của dân số nghiên cứu ............................................................ 47 iii 3.2. Đặc điểm đột biến vùng Precore, Basal Core Promoter của dân số nghiên cứu ...................................................................................................... 52 3.3. Yếu tố liên quan với đột biến A1762T/G1764A và G1896A . 57 3.4. Liên quan giữa đột biến đột biến G1896A và A1762T/G1764A và thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát ..................................................................... 60 3.5. Liên quan giữa đột biến vùng precore và basal core promoter với biến chứng xơ gan .................................................................................................. 62 3.6. Liên quan giữa đột biến vùng precore và basal core promoter với biến chứng ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) ...................................................... 65 Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 70 4.1. Về phương pháp nghiên cứu .................................................................... 70 4.2. Về đặc điểm dân số nghiên cứu và đặc điểm nhiễm HBV ....................... 71 4.3. Về đặc điểm đột biến ở vùng precore và basal core promoter của dân số nghiên cứu ....................................................................................................... 77 4.4. Về yếu tố liên quan với đột biến A1762T/G1764A và G1896A............. 81 4.4. Về liên quan giữa đột biến A1762T/G1764A, G1896A và thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát .............................................................................. 88 4.5. Về liên quan giữa đột biến vùng Precore và Basal core promoter với biến chứng Xơ gan .......................................................................................... 91 4.6. Về liên quan giữa đột biến vùng Precore và Basal core promoter với biến chứng HCC .............................................................................................. 96 KẾT LUẬN .................................................................................................... 103 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng thu thập số liệu Phụ lục 2: Trang thông tin nghiên cứu và Phiếu đồng thuận Phụ lục 3: Giấy chấp thuận của Hội đồng đạo đức Phụ lục 4: Danh sách bệnh nhân iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ aa acid amin A Adenin AFP Alfa-fetoprotein ALT Alanine transaminase APRI Aspartate aminotransferase to Platelet Ratio index ARFI Acoustic Radiation Force Impulse Imaging AST Aspartate transaminase Anti HBc anti Hepatitis B core Anti HBe anti Hepatitis B e Anti HBs anti hepatitis B surface ARMS - PCR Amplifications refractory mutation system BCP Basal core promoter C Cytosin CHBe(+) Chronic Hepatitis B HBeAg positive CHBe(-) Chronic Hepatitis B HBeAg negative CI Confidence interval CTL Cytotoxic T lymphocyte DNA DeoxyRibo Nucleic acid dNTP deoxy Nucleotide triphosphate DNMD Dung nạp miễn dịch EN Enhancer G Guanin HBcAg Hepatitis B core antigen HBeAg Hepatitis B e antigen HBsAg Hepatitis B virus surface antigen HBV Hepatitis B virus HCC Hepato-cellular carcinoma IC Inactive carrier v IDU Intravenous drug user IU International unit MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification mRNA Messenger RiboNucleic acid OR Odd Ratio ORF Open reading frame PC Precore PCR Polymerase chain reaction pgRNA pregenomic Ribo Nucleic acid rcDNA relaxed circular DeoxyRibo Nucleic acid RE Restriction enzyme RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RT Reverse transcriptase SD Standard deviation SNP Single nucleotide polymorphism T Thymin TB Trung bình TDF Tenofovir disoproxil fumarate ULN Upper limit normal VEM Vaccin escape mutant vi DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt APRI Aspartate aminotransferase to Platelet Ratio index Chỉ số tỷ số AST trên tiểu cầu Anti HBc anti Hepatitis B core Kháng thể chống kháng nguyên lõi Anti HBe anti Hepatitis B e Kháng thể chống kháng nguyên e Anti HBs anti hepatitis B surface Kháng thể chống kháng nguyên bề mặt ARMS - PCR Amplifications refractory mutation system Hệ thống khuếch đại chịu nhiệt CHBe(+) Chronic Hepatitis B HBeAg positive Viêm gan B mạn HBeAg dương CHBe(-) Chronic Hepatitis B HBeAg negative Viêm gan B mạn HBeAg âm CI Confidence interval Khoảng tin cậy CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào lympho T gây độc EN Enhancer Tăng cường HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi của HBV HBeAg Hepatitis B e antigen Kháng nguyên HBe HBsAg Hepatitis B virus surface antigen Kháng nguyên bề mặt HBV HBV Hepatitis B virus Siêu vi viêm gan B HCC Hepato cellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan IC Inactive carrier Mang siêu vi không hoạt tính IDU Intravenous drug user Người tiêm chích ma tuý IU International unit Đơn vị quốc tế MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification Kỹ thuật khuếch đại phụ thuộc mẫu dò mRNA Messenger RiboNucleic acid RNA thông tin OR Odd Ratio Tỉ số chênh ORF Open reading frame Khung đọc mã mở PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi gen vii pgRNA pregenomic Ribo Nucleic acid RNA tiền gen rcDNA relaxed circular DeoxyRibo Nucleic acid DNA vòng thẳng RE Restriction enzyme Enzym cắt giới hạn RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Nghiên cứu đa hình đoạn gen sử dụng Enzym cắt giới hạn RT Reverse transcriptase Men sao mã ngược SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SNP Single nucleotide polymorphism Đột biến một nucleotide ULN Upper limit normal Giới hạn trên so với bình thường VEM Vaccin escape mutant Đột biến trốn thoát vac-xin viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Tỷ lệ ước tính của đột biến G1896A ở các nhóm nghiên cứu và cỡ mẫu cần thiết để so sánh với tỷ lệ ở nhóm dung nạp miễn dịch 34 Bảng 2.2: Danh mục mồi xác định HBV genotype sử dụng trong nghiên cứu 41 Bảng 3.1. Đặc điểm của dân số nghiên cứu 47 Bảng 3.2: Đặc điểm dấu ấn nhiễm HBV của dân số nghiên cứu 48 Bảng 3.3: Phân bố giới theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV . 49 Bảng 3.4: Phân bố genotype theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV . 50 Bảng 3.5: Tỉ lệ đột biến vùng BCP của dân số nghiên cứu 52 Bảng 3.6: Tỉ lệ đột biến vùng Precore và vùng Core . 53 Bảng 3.7: Phân bố đột biến A1762T/G1764A theo tuổi, giới, đặc điểm nhiễm HBV 57 Bảng 3.8: Các yếu tố liên quan với đột biến với A1762T/G1764A-Phân tích đa biến 58 Bảng 3.9: Phân bố đột biến G1896A theo tuổi, giới, đặc điểm nhiễm HBV 59 Bảng 3.10: Các yếu tố liên quan với đột biến Precore – Phân tích đa biến . 60 Bảng 3.11: Phân bố thể bệnh viêm gan hoạt tính theo tình trạng đột biến G1896A và A1762T/G1764A 60 Bảng 3.12: Phân bố đột biến G1896A trong các thể viêm gan ở bệnh nhân viêm gan có hoạt tính phân tầng theo đột biến A1762T/G1764A 62 Bảng 3.13: Liên quan giữa các tổ hợp đột biến G1896A, A1762T/G1764A với thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát – Phân tích đơn biến 61 Bảng 3.14: Phân bố tuổi và giới, dấu ấn nhiễm HBV ở nhóm có và không có xơ gan 62 Bảng 3.15: Phân bố đột biến vùng Basal core promoter ở hai nhóm có và không có xơ gan 63 Bảng 3.16: Phân bố đột biến vùng Precore và core ở hai nhóm có và không có xơ gan . 64 Bảng 3.17: Các yếu tố liên quan độc lập với biến chứng xơ gan – Phân tích đa biến 65 Bảng 3.18: Đặc điểm tuổi, giới, tình trạng xơ hoá gan, dấu ấn nhiễm HBV giữa hai nhóm có và không có HCC 66 ix Bảng 3.19: Phân bố đột biến vùng Basal core promoter ở nhóm có và không có HCC 67 Bảng 3.20: Phân bố đột biến vùng Precore, core ở nhóm có và không có HCC .. 67 Bảng 3.21: Các yếu tố liên quan độc lập với biến chứng HCC – Phân tích đa biến . 68 x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Phân bố địa lý của nhiễm HBV trên thế giới ................................ 5 Hình 1.2: Phân bố genotype của HBV trên thế giới ...................................... 6 Hình 1.3: Diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn .............................................. 10 Hình 1.4: Cấu trúc của HBV ......................................................................... 14 Hình 1.5: Cấu trúc bộ gen của HBV ............................................................. 15 Hình 1.6: Kỹ thuật RFLP .............................................................................. 18 Hình 1.7: Kỹ thuật giải trình tự DNA ........................................................... 20 Hình 1.8: Kết quả giải trình tự gen tìm đột biến Precore G1896A ............... 20 Hình 1.9: Kết quả giải trình tự gen tìm đột biến A1762T/G1764A............... 20 Hình 1.10: Liên quan giữa đột biến precore và genotype của HBV .............. 23 Hình 3.1: Có đột biến G1896A, T1753C, A1762T/G1764A, C1766T/C 56 xi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thực hiện .. 44 Sơ đồ 2.2: Mô hình nghiên cứu ... 45 Sơ đồ 3.1: Thu nhận mẫu nghiên cứu 46 Biểu đồ 3.1: Phân bố tuổi theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV . 49 Biểu đồ 3.2: Tải lượng HBV theo giai đoạn nhiễm HBV . 50 Biểu đồ 3.3: Lượng HBsAg theo nhóm giai đoạn nhiễm HBV . 51 Biểu đồ 3.4. Phân bố đột biến T1753V, A1762T/G1764A, G1896A ở các nhóm tuổi . 54 Biểu đồ 3.5: Phân bố đột biến G1896A, A1762T/G1764A ở các nhóm giai đoạn diễn biến nhiễm HBV mạn 55 1 MỞ ĐẦU Nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV) mạn là vấn đề sức khoẻ quan trọng của toàn cầu và Châu Á Thái Bình Dương. Trên người, kết cục của nhiễm HBV mạn thay đổi theo tuổi nhiễm HBV và các đặc điểm siêu vi, là kết quả của quá trình tương tác giữa siêu vi và đáp ứng của ký chủ. Tại các vùng lưu hành cao như châu Á và Việt Nam, nhiễm HBV thường xảy ra sớm từ tuổi sơ sinh, nguy cơ diễn tiến mạn tính cao, vì thế nhiễm HBV mạn có liên quan có ý nghĩa đến tần suất cao của bệnh gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Liên quan đến yếu tố siêu vi, y văn đã thừa nhận đột biến G1896A ở vùng Precore (PC) và đột biến kép A1762T/G1764A ở vùng Basal core promoter (BCP) gây giảm biểu lộ HBeAg và có ảnh hưởng quan trọng trong quá trình diễn biến tự nhiên này. Tuy vậy, các dữ kiện về HBeAg và các đột biến liên quan này vẫn còn chưa được chú ý trong nhiều đồng thuận của các khu vực trên thế giới, làm cho việc đánh giá ảnh hưởng của các đột biến này chưa được đúng mức trong thực hành lâm sàng. Mức độ phổ biến của các đột biến ở từng khu vực phân bố của genotype vẫn chưa được nghiên cứu đủ. Theo các nghiên cứu đã thực hiện, đột biến G1896A chiếm ưu thế hơn ở vùng phân bố của genotype B và D (93% ở Trung Đông, 52% ở Châu Á Thái Bình Dương) [48]; đột biến A1762T/G1764A ưu thế hơn ở vùng lưu hành của genotype C [28]. Cho đến nay, vẫn còn nhiều ý kiến trái chiều về chủng đột biến vùng PC, BCP là có lợi hay có hại. Đa số tác giả cho rằng khi chủng đột biến trở nên ưu thế trong quần thể, vai trò kiểm soát miễn dịch của người nhiễm mạn tính đối với HBV không còn hiệu quả, siêu vi tái hoạt và kích thích miễn dịch như một chủng HBV mới, gây nên những đợt thải trừ miễn dịch mới làm cho diễn tiến bệnh gan trở nên không ổn định, diễn biến suy gan và biến chứng [83], [156]. Các nhận định này dựa trên các tỷ lệ các đột biến vùng PC, BCP thấp được tìm thấy ở người lành mang HBV và cao hơn ở người có viêm gan hoạt tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) [148, 163], [12, 170]. Ngược lại, có tác giả lại cho rằng các đợt viêm gan cấp liên 2 quan với hình thành chủng đột biến tạo nên cơ hội thải trừ HBV hiệu quả hơn, chuyển huyết thanh HBeAg, thậm chí có thể chuyển huyết thanh HBsAg [159]. Từ năm 2010, đột biến G1896A và A1762T/G1764A được Chu và cộng sự đề nghị xem là một trong các tiêu chí để phân biệt trạng thái mang HBV không hoạt tính và viêm gan B mạn tái hoạt [32]; đột biến A1762T/G1764A còn được Kao và cộng sự đề nghị sử dụng trong thang điểm đánh giá nguy cơ HCC khi quản lý bệnh nhân nhiễm HBV mạn năm 2014 [70]. Cho đến nay, dữ liệu được công bố về tỷ lệ đột biến khác nhau nhiều giữa các nghiên cứu có lẽ do sự khác biệt về phân bố nhóm tuổi, genotype, mức độ bệnh lý gan, giai đoạn diễn biến nhiễm HBV, tải lượng HBV và giai đoạn có biến chứng xơ gan, HCC. Tại Việt Nam, tỷ lệ G1896A trong nghiên cứu của tác giả Trần Thiện Tuấn Huy (năm 2004) là 32,8% [60] và của tác giả Dunford L. 8 năm sau đó (năm 2012) vẫn là 34% [100] và tỷ lệ A1762T/G1764A trong 2 nghiên cứu này là 33,3% và 22%. Các nghiên cứu sau năm 2010 tại Việt Nam cũng tìm thấy đột biến G1896A và A1762T/G1764A phổ biến hơn ở giai đoạn viêm gan B hoạt tính, nhất là trong giai đoạn chuyển huyết thanh HBeAg và ở giai đoạn có biến chứng HCC [4], [147],[1], [2] . Các nghiên cứu này đã bắt đầu cho thấy ảnh hưởng của đột biến vùng PC, BCP trên diễn biến nhiễm HBV nhưng các công bố này dựa trên dữ liệu với cỡ mẫu còn nhỏ, và chưa đề cập đến ảnh hưởng của các kết hợp đột biến trên người nhiễm HBV mạn. Qua các nghiên cứu đã thực hiện trên có thể nhận ra rằng sự phân bố đột biến vùng PC hay BCP có khác nhau ở các giai đoạn diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn; là có lợi hay có hại cho tiến triển bệnh; có liên quan thế nào đến viêm gan bùng phát, xơ gan và HCC còn là những câu hỏi cần được trả lời tiếp. Các dữ liệu này rất quan trọng để làm cơ sở đưa ra các quyết định thích hợp trong quản lý bệnh nhân nhiễm HBV tại Việt Nam. 3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Mô tả và so sánh tỷ lệ đột biến A1762T/G1764A và G1896A ở bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mạn thuộc các giai đoạn của diễn tiến tự nhiên (dung nạp miễn dịch, viêm gan B mạn HBeAg dương, mang HBV không hoạt tính, viêm gan B mạn HBeAg âm) và ở bệnh nhân nhiễm HBV có biến chứng xơ gan và Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). 2. Xác định các yếu tố liên quan đến đột biến A1762T/G1764A và G1896A. 3. Phân tích liên quan giữa đột biến vùng Precore và vùng Basal core promoter với thể bệnh viêm gan B mạn bùng phát, biến chứng xơ gan và HCC ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn. 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC NHIỄM HBV 1.1.1. Tỷ lệ nhiễm HBV trên thế giới Nhiễm HBV là một trong các vấn đề sức khoẻ toàn cầu quan trọng. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, toàn thế giới có khoảng 2 tỉ người, tương đương với một phần ba dân số đã từng nhiễm HBV (anti HBc dương), gây khoảng 257 triệu người nhiễm HBV mạn [154]. Tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính (có dấu ấn HBsAg dương tính) trong cộng đồng thay đổi từ 2-20% [69, 94]. Về phân bố của nhiễm HBV, thế giới được chia thành 3 vùng lưu hành. Vùng lưu hành cao có ≥ 8% dân số mang HBsAg. Vùng lưu hành trung bình có 2-7% dân số và vùng lưu hành thấp có < 2% dân số mang HBsAg. Khoảng 45% dân số thế giới sống ở châu Phi, châu Á, vùng Amazon và Trung Đông là vùng lưu hành cao của HBV với nguy cơ nhiễm HBV trong suốt cuộc sống là hơn 60%. Đường lây truyền HBV trong vùng lưu hành cao chủ yếu là bị lây qua chu sinh hay lây qua đường dọc, nghĩa là lây từ mẹ sang con hoặc trong lứa tuổi nhỏ hơn 2 tuổi qua đường xuyên qua da do tiếp xúc với máu và dịch tiết của người nhiễm HBV [39]. Chỉ khoảng 12% dân số thế giới sống ở vùng lưu hành thấp như Mỹ, Tây Âu và Úc, là những nơi có tỷ lệ mang HBsAg < 1% với nguy cơ nhiễm HBV trong suốt cuộc sống < 20%. Đường lây truyền chủ yếu trong vùng lưu hành thấp là lây truyền ngang ở tuổi trưởng thành qua quan hệ tình dục, qua sử dụng bơm tiêm nhiễm khuẩn hay sử dụng chất gây nghiện qua đường tĩnh mạch [39]. Phần còn lại của dân số thế giới sống ở vùng lưu hành trung bình như Đông và Nam Âu, Nga, Trung và Nam Mỹ với tỷ lệ mang HBsAg từ 1-7% và nguy cơ nhiễm HBV trong suốt cuộc sống từ 20-60% [39]. 1.1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam Việt Nam thuộc vùng tây Thái Bình Dương và Đông Nam Á (vùng lưu hành cao của HBV) với tỷ lệ mang HBsAg từ 7-12%. Năm 1993, nhóm nghiên cứu Nakata và 5 Phạm Song khảo sát 1754 bệnh nhân ở Hà Nội và TP. HCM ghi nhận tỷ lệ mang HBsAg (+) lần lượt là 16% và 10%, không khác biệt ở nhóm nguy cơ thấp và cao. Tỷ lệ mang HBsAg ở trẻ < 1 tuổi cao khoảng 10% được sinh từ mẹ nhiễm HBV có HBeAg (+) [111]. Trong khảo sát 1200 mẫu máu từ những người cho máu ở tỉnh Quảng Trị năm 2007, tác giả Le Viet ghi nhận có 11,4% có HBsAg (+), 51,7% anti HBc (+) [151]. Năm 2012, nhóm nghiên cứu gồm có tác giả Dunford và cộng sự khảo sát 8654 mẫu máu ở Hà Nội, Hải Phòng, Khánh Hòa và Cần Thơ cũng ghi nhận tỷ lệ mang HBsAg trong dân số nghiên cứu là 10,7%, tỷ lệ mang HBsAg trong nhóm ng