Luận án Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng kháng ung thư của viên nén nổi chứa curcumin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIÊN NÉN NỔI CHỨA CURCUMIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh-Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIÊN NÉN NỔI CHỨA CURCUMIN Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc Mã số: 62720402 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. HUỲNH VĂN HÓA 2. PGS. TS. VĨNH ĐỊNH Thành phố Hồ Chí Minh-Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Duyên ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan ............................................................................................................. i Mục lục ...................................................................................................................... ii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ................................................................. iv Danh mục các bảng ................................................................................................. vi Danh mục các hình .................................................................................................. ix Danh mục các biểu đồ ............................................................................................. xi ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN ...................................................................... 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH-ĐỘ ỔN ĐỊNH VÀ TUỔI THỌ CỦA THUỐC................................................................................ 5 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ HỆ PHÂN TÁN RẮN (HPTR) ĐỂ CẢI THIỆN ĐỘ HÒA TAN CỦA CURCUMIN ............................... 9 1.4. TỔNG QUAN VỀ DẠNG THUỐC NỔI TRONG DẠ DÀY ....................... 15 1.5. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY-CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH TẾ BÀO VÀ MÔ HÌNH GÂY UNG THƯ DẠ DÀY TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG ....................................................................................... 20 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 31 2.1. VẬT LIỆU ...................................................................................................... 31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 59 3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN TRONG HPTR BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis VÀ TRONG VIÊN NÉN NỔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ................................................ 59 3.2. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HPTR CHỨA CURCUMIN CÓ ĐỘ HÒA TAN CAO BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẤT MANG KHÁC NHAU ........... 69 iii 3.3. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NÉN NỔI CHỨA HỆ PHÂN TÁN RẮN CURCUMIN 100 MG ........................................................................................... 78 3.4. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ DẠ DÀY CỦA THÀNH PHẦN CÔNG THỨC VIÊN NÉN NỔI CHỨA HPTR CURCUMIN 100 MG TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ Ở NGƯỜI (IN VITRO) VÀ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (IN VIVO) .................................................................................... 92 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .....................................................................................100 4.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN TRONG HPTR BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis VÀ TRONG VIÊN NÉN NỔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ..............................................100 4.2. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ PHÂN TÁN RẮN CHỨA CURCUMIN CÓ ĐỘ HÒA TAN CAO BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẤT MANG KHÁC NHAU ..................................................................................................................105 4.3. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NÉN NỔI CHỨA HỆ PHÂN TÁN RẮN CURCUMIN 100 MG .........................................................................................110 4.4. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ DẠ DÀY CỦA THÀNH PHẦN CÔNG THỨC VIÊN NÉN NỔI CHỨA HPTR CURCUMIN 100 MG TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ Ở NGƯỜI (IN VITRO) VÀ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (IN VIVO) ..................................................................................117 KẾT LUẬN ............................................................................................................125 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................127 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Stt Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 1 5-FU 5-fluorouracil 2 ACN Acetonitril 3 ASEAN Association of Southeast Asian Nations Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á 4 B(a)P Benzo(a)pyren 5 CD Cyclodextrin 6 Cur Curcumin 7 DAD Diode array detector Đầu dò dãy diod quang 8 DM Phương pháp dung môi 9 DMBA 7,12 dimethyl benzanthracene 10 DMSO Dimethyl sulfoxide 11 DSC Differential Thermal Analysis Phân tích nhiệt vi sai 12 HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 HPMC Hydropropyl methylcellulose 14 HPTR Hệ phân tán rắn 15 IC50 The half maximal inhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế 50% sinh vật thử nghiệm 16 ICH International Conference on Harmonization Hội nghị quốc tế về hài hòa 17 IR Infrared Hồng ngoại 18 MeOH Methanol 19 mtb Khối lượng trung bình 20 MTT 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromid) 21 N Phương pháp nghiền v Stt Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 22 PEG Polyethylenglycol 23 PVP Polyvinylpyrrolidon 24 RH Relative humidity Độ ẩm tương đối 25 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối 26 SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn 27 SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét 28 UTDD Ung thư dạ dày 29 UV-Vis Ultraviolet-Visible Tử ngoại khả kiến 30 VL Phương pháp vật lý 31 VNN Viên nén nổi vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. 1. Một số chế phẩm thuôc nổi trên thị trường ............................................. 20 Bảng 1. 2. Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày theo Tổ chức Y tế Thế giới năm 2010 ........................................................................................................................... 21 Bảng 1. 3. Một số nghiên cứu tác dụng của curcumin trên mô hình gây ung thư khác trên chuột .......................................................................................................... 30 Bảng 2. 1. Các nguyên liệu sử dụng trong bào chế .................................................. 31 Bảng 2. 2. Các nguyên liệu sử dụng trong phân tích ................................................ 32 Bảng 2. 3. Các nguyên liệu và động vật sử dụng trong thử in vitro và in vivo ........ 32 Bảng 2. 4. Các trang thiết bị được sử dụng trong đề tài ........................................... 33 Bảng 2. 5. Các điều kiện thăm dò ............................................................................. 37 Bảng 2. 6. Các công thức bào chế HPTR và hỗn hợp trộn vật lý ............................. 41 Bảng 2. 7. Thành phần công thức cơ bản của viên placebo ..................................... 45 Bảng 2. 8. Thành phần công thức thăm dò các tá dược tạo khung ........................... 46 Bảng 2. 9. Điều kiện và tần số thử nghiệm trong nghiên cứu độ ổn định ................ 50 Bảng 2. 10. Các chỉ tiêu đánh giá, mức chất lượng và số lượng viên nén nổi curcumin 100 mg dùng trong nghiên cứu độ ổn định ............................................... 51 Bảng 2. 11. Nồng độ thử nghiệm .............................................................................. 54 Bảng 3. 1. Sai lệch độ hấp thu của các hệ tá dược so với mẫu giả định ................... 59 Bảng 3. 2. Sự tuyến tính giữa độ hấp thu theo nồng định lượng .............................. 61 Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng HPTR curcumin với hệ chất mang PVP K30+Tween 80 ..................................................... 62 Bảng 3. 4. Kết quả thử độ đúng phương pháp định lượng HPTR curcumin ............ 62 Bảng 3. 5. Giá trị trung bình các thông số sắc ký của mẫu chuẩn curcumin ở các pha động khảo sát (n=6) ............................................................................................ 63 vii Bảng 3. 6. Tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn curcumin ............................. 64 Bảng 3. 7. Tính tương thích hệ thống trên mẫu thử viên nén nổi chứa HPTR curcumin .................................................................................................................... 64 Bảng 3. 8. Kết quả khảo sát tính tuyến tính .............................................................. 66 Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát độ đúng ........................................................................ 67 Bảng 3. 10. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp .................................................... 68 Bảng 3. 11. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian ............................................. 68 Bảng 3. 12. Độ hoà tan của curcumin nguyên liệu ................................................... 69 Bảng 3. 13. Độ hoà tan của HPTR curcumin với hệ β-CD và Tween 80 ................. 70 Bảng 3. 14. Độ hoà tan của HPTR curcumin với hệ β-CD và PVP K30 ................. 70 Bảng 3. 15. Độ hoà tan của HPTR curcumin với hệ PEG 6000/PVP K30 (10:90) . 71 Bảng 3. 16. Độ hoà tan của HPTR curcumin với hệ PEG 6000/PVP K30 (25:75) . 71 Bảng 3. 17. Độ hoà tan của HPTR curcumin với hệ PEG 6000/HPMC 606 (15:85) ................................................................................................................................... 72 Bảng 3. 18. Độ hoà tan của HPTR curcumin với hệ PVP K30 và Tween 80 .......... 72 Bảng 3. 19. Độ hoà tan của curcumin từ các HPTR với các hệ chất mang .............. 73 Bảng 3. 20. So sánh độ hoà tan giữa các cặp ............................................................ 74 Bảng 3. 21. Độ lặp lại quá trình hoà tan của HPTR curcumin với hệ chất mang PVP K30 và Tween 80 bào chế bằng phương pháp nghiền ướt-công thức 1 ................... 74 Bảng 3. 22. Kết quả khảo sát hàm lượng tá dược dính ............................................. 79 Bảng 3. 23. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi xát hạt ................................................. 79 Bảng 3. 24. Kết quả ảnh hưởng của loại tá dược tạo khí đến khả năng nổi của viên ................................................................................................................................... 80 Bảng 3. 25. Kết quả đánh giá khả năng nổi của viên khi thay đổi tỉ lệ NaHCO3 và acid citric ................................................................................................................... 80 Bảng 3. 26. Kết quả đánh giá sử dụng gôm xanthan đến khả năng nổi của viên .... 81 Bảng 3. 27. Kết quả đánh giá sử dụng HPMC K4M đến khả năng nổi của viên .... 81 Bảng 3. 28. Kết quả đánh giá sử dụng HPMC K15M đến khả năng nổi của viên .. 82 viii Bảng 3. 29. Kết quả đánh giá sử dụng HPMC 615 đến khả năng nổi của viên ...... 82 Bảng 3. 30. Kết quả đánh giá khả năng nổi của viên khi phối hợp polyme ............. 83 Bảng 3. 31. Kết quả ảnh hưởng của độ cứng đến khả năng nổi của viên ................. 84 Bảng 3. 32. Mô hình công thức được xây dựng bởi phần mềm Design-Expert ....... 85 Bảng 3. 33. Kết quả thực nghiệm ............................................................................. 85 Bảng 3. 34. Thành phần công thức tối ưu ................................................................. 86 Bảng 3. 35. Kết quả thực nghiệm 3 lô kiểm chứng và kết quả dự đoán ................... 86 Bảng 3. 36. Độ hòa tan từ viên nén nổi chứa HPTR curcumin:PVP:Tween (1:4: 0,22) và viên nén nổi chứa curcumin nguyên liệu .................................................... 87 Bảng 3. 37. Kết quả kiểm nghiệm 03 lô ................................................................... 88 Bảng 3. 38. Kết quả thử nghiệm độ ổn định của 3 lô ở điều kiện lão hóa cấp tốc tại thời điểm 6 tháng ....................................................................................................... 90 Bảng 3. 39. Kết quả thử nghiệm độ ổn định của 3 lô ở điều kiện thử nghiệm dài hạn tại thời điểm 24 tháng................................................................................................ 91 Bảng 3. 40. Tác dụng của các mẫu thử lên tỷ lệ sống của tế bào ung thư dạ dày N87 ................................................................................................................................... 92 Bảng 3. 41. Tỷ lệ % ức chế phát triển tế bào ung thư của các mẫu thử ................... 93 Bảng 3. 42. Phương trình hồi quy và giá trị IC50 của các mẫu thử ........................... 93 Bảng 3. 43. Số chuột chết ở các lô thử nghiệm ............................................................ 95 Bảng 3. 44. Tỷ lệ chuột mang u ngoài da ở các lô từ tuần 5 đến tuần 24 ................ 96 Bảng 3. 45. Chỉ số mỡ của chuột ở các lô từ tuần 5 đến tuần 24 ............................. 97 Bảng 3. 46. So sánh kết quả đại thể giữa các lô từ tuần 5 đến tuần 24 ............................... 97 Bảng 3. 47. So sánh kết quả vi thể ở các lô ở tuần 5 đến tuần 24 ............................ 99 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. 1. Cấu trúc của curcumin ............................................................................... 3 Hình 1. 2. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin ............. 4 Hình 2. 1. Sơ đồ tóm tắt quy trình bào chế viên nén nổi lô 2000 viên ..................... 48 Hình 3. 1. Phổ UV-Vis của mẫu chuẩn curcumin, mẫu thử HPTR curcumin/(PVP K30 + Tween 80) và hệ tá dược PVP K30 + Tween 80 trong đệm pH 1,2 .............. 60 Hình 3. 2. Phổ UV-Vis của mẫu chuẩn curcumin có sử dụng methanol trong giai đoạn đầu xử lý mẫu, mẫu trắng đệm pH 1,2 và mẫu trắng methanol ....................... 60 Hình 3. 3. Sắc ký đồ curcumin chuẩn ở điều kiện 6 ................................................. 63 Hình 3. 4. Phổ sắc ký đồ dung môi pha mẫu MeOH (1), pha động (2), mẫu trắng (3), mẫu chuẩn (4), mẫu thử (5) và mẫu thử thêm chuẩn (6) .................................... 65 Hình 3. 5. Phổ sắc ký đồ mẫu phân hủy trong NaOH 1N (1), mẫu phân hủy trong H2O2 30% (2), mẫu phân hủy ở 80 o C (3), mẫu phân hủy bằng ánh sáng (4), mẫu phân hủy trong đệm pH 8 (5) và mẫu chuẩn (6) ....................................................... 65 Hình 3. 6. Phổ IR của curcumin NL ......................................................................... 75 Hình 3. 7. Phổ IR của tá dược .................................................................................. 75 Hình 3. 8. Phổ IR của HPTR curcumin .................................................................... 75 Hình 3. 9. Chồng phổ IR .......................................................................................... 75 Hình 3. 10. Phổ DSC của tá dược............................................................................. 76 Hình 3. 11. Phổ DSC của curcumin NL ................................................................... 76 Hình 3. 12. Phổ DSC của HPTR curcumin .............................................................. 76 Hình 3. 13. Chồng phổ DSC ..................................................................................... 76 Hình 3. 14. SEM của curcumin NL .......................................................................... 77 Hình 3. 15. SEM của tá dược ................................................................................... 77 Hình 3. 16. SEM của HPTR curcumin ..................................................................... 77 x Hình 3. 17. Hình ảnh X-quang dạ dày chó .............................................................. 89 Hình 3. 18. Tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường; (b) Tế bào xử lý với môi trường chứa DMSO 0,5% (tt/tt) sau 48 giờ (10X, Zoom 5.6) ........................... 92 Hình 3. 19. Hình thái tế bào N87 sau 48 giờ xử lý với các mẫu thử (10X, Zoom 5.6) ................................................................................................................................... 94 Hình 3. 20. Khối u ngoài da trên chuột sau khi uống DMBA .................................. 96 Hình 3. 21. Đại thể dạ dày có khối u ........................................................................ 98 Hình 3. 22. Đại thể dạ dày bình thường ................................................................... 98 Hình 3. 23. Vi thể dạ dày ung thư ............................................................................ 99 Hình 3. 24. Vi thể dạ dày bình thường ..................................................................... 99 xi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3. 1. Đồ thị tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ dung dịch curcumin chuẩn ......................................................................................................................... 61 Biểu đồ 3. 2. Đồ thị tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ curcumin chuẩn ... 67 Biểu đồ 3. 3. Đồ thị biểu diễn độ hoà tan của curcumin từ các HPTR với các hệ chất mang khác nhau ......................................................................................................... 73 Biểu đồ 3. 4. Đồ thị biểu diễn độ hoà tan của cucumin nguyên liệu và công thức hệ phân tán rắn N_F3 ở các khoảng thời gian bảo quản ................................................ 78 Biểu đồ 3. 5. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của curcumin chứa HPTR curcumin:PVP:Tween (1:4: 0,22) và viên nén nổi chứa curcumin nguyên liệu ....... 87 Biểu đồ 3. 6. Sự thay đổi khối lượng chuột ở các lô thử nghiệm ............................. 96 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến và là nguyên nhân tử vong do ung thư cao thứ tư trên thế giới; Việt Nam thuộc khu vực có trung bình nguy cơ ung thư dạ dày cao, với tỷ lệ mắc mới cả nam và nữ là 16,3/ 100.000 dân [119]. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị nhưng tiên lượng ung thư dạ dày hiện nay vẫn còn xấu với tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ khoảng 28%. Các liệu pháp hóa trị là cần thiết ở đa số bệnh nhân nhưng với độc tính cao do những hoá chất tổng hợp tấn công không đặc hiệu cả tế bào ung thư và tế bào bình thường làm ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân. Vì vậy, việc hướng tới tìm các hợp chất có nguồn gốc dược liệu để hỗ trợ điều trị vừa hiệu quả và vừa an toàn đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Curcumin là thành phần chính của thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L. Zingiberaceae) đã được nghiên cứu với nhiều công dụng như kháng ung thư (ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư kết tràng, ung thư vú, ung thư da), kháng viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn (Helicobacter pylori), kháng virus, kháng nấm [37], [49], [59], [68], [71], [87] Các thử nghiệm sinh học đã chứng minh, curcumin thật sự hiệu quả trong việc phối hợp điều trị ung thư đặc biệt là ung thư dạ dày [8], [37], [81] và an toàn ngay cả khi dùng liều cao. Với sự an toàn và hiệu quả, curcumin là hợp chất thiên nhiên có nhiều tiềm năng ứng dụng tron