Luận án Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN Chuyên ngành : Sinh lý học thực vật Mã số : 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI, 2015 i Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận quản lý đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Khoa học Công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc-Phòng Công nghệ tế bào thực vật, PGS.TS. Lê Văn Sơn-Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành đề tài này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, các bạn đồng nghiệp, những ngƣời đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 6 năm 2015 Nghiên cứu sinh La Việt Hồng ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, một phần đã công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 19 tháng 6 năm 2015 Tác giả La Việt Hồng iii Mục lục Lời cảm ơn .................................................................................................................. i Lời cam đoan .............................................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2 4. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn ....................................................................... 3 4.1. Ý nghĩa lý luận ................................................................................................. 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3 5. Đóng góp mới của luận án ...................................................................................... 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4 1.1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN ..... 4 1.1.1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt ..................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin .......................................... 6 1.2. TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT............................................................................................................... 14 1.2.1. Lựa chọn hệ thống biểu hiện ....................................................................... 14 1.2.2. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) ....................................... 15 1.2.3. Ảnh hƣởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển ............................ 20 1.2.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện .. 20 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA ................................................................................................. 22 1.3.1. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) ............. 22 1.3.2. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật ................................................................. 24 1.3.3. Cây cà chua chuyển gen .............................................................................. 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30 iv 2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................... 30 2.1.1. Vật liệu thực vật .......................................................................................... 30 2.1.2. Vector và chủng vi khuẩn ........................................................................... 30 2.1.3. Hóa chất và thiết bị máy móc ...................................................................... 31 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 31 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 31 2.2.1. Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà ................................................................................................................ 33 2.2.2. Thiết kế mồi ................................................................................................ 34 2.2.3. Phân lập promoter và terminator ................................................................. 34 2.2.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin ........................................ 38 2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen ......................................................................................................................... 41 2.2.6. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen .................................... 43 2.2.7. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................. 44 2.2.8. Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen .............................. 47 2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ..................................................... 48 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 49 3.1. THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ. PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ TERMINATOR HSP 18.2 ........................................................................................ 49 3.1.1. Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây họ cà ...................................................................................................................... 49 3.1.2. Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis ....................................................................................... 51 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA ..................................................... 58 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter ........................ 58 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter ......................... 60 3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter ........................... 62 3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter ........................ 63 v 3.2.5. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium ....... 65 3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ ............................................................. 66 3.3.1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 ................... 66 3.3.2. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá ......................... 71 3.4. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY CÀ CHUA ................................................................................................................. 79 3.4.1. Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin ..................................................... 79 3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR ......................................................................................................... 83 3.4.3. Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng cà chua chuyển gen ............................................................................................... 84 3.4.4. Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật Southern ................................................................................................................ 85 3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số dòng cà chua chuyển gen............................................................................................................. 86 Chƣơng 4. THẢO LUẬN .......................................................................................... 91 4.1. Tăng cƣờng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật ..................... 91 4.2. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá ....... 94 4.3. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen ....................... 99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 104 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............ 105 SUMMARY ............................................................................................................ 106 1. Overview: ........................................................................................................ 106 2. Objectives: ....................................................................................................... 107 3. Contents: ......................................................................................................... 107 4. Results: ............................................................................................................ 107 5. Discussion: ...................................................................................................... 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 112 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt 4 Bảng 1.2. So sánh ƣu nhƣợc điểm giữa các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 14 Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng lai ghép tạo vector tái tổ hợp 37 Bảng 3.1. So sánh trình tự promoter E8 phân lập với trình tự promoter E8 đã công bố 53 Bảng 3.2. So sánh trình tự nucleotide của promoter HSP 18.2 phân lập đƣợc với các trình tự gen/promoter HSP 18.2 đã công bố 56 Bảng 3.3. Kết quả tạo và chọn lọc các dòng tế bào BY2 mang gen chuyển miraculin 66 Bảng 3.4. Khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của một số dòng tế bào BY2 chuyển gen 69 Bảng 3.5. Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen miraculin 72 Bảng 3.6. Khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của một số dòng rễ tơ chuyển gen 75 Bảng 3.7. Chỉ tiêu chiều dài của một số dòng rễ tơ chuyển gen 76 Bảng 3.8. Kết quả tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin 81 Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu sinh trƣởng và hình thái của năm dòng cà chua chuyển gen 87 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) và quả cắt dọc 7 Hình 1.2. Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer 9 Hình 1.4. Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt 10 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32 Hình 3.1. Trình tự gen miraculin trƣớc (AB512278.1) và sau khi thay đổi mã di truyền 50 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter E8 52 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter HSP 18.2 55 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng terminator HSP 18.2 57 Hình 3.5. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58 Hình 3.6. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 59 Hình 3.7. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S/Mir/HSP-ter 61 Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62 Hình 3.9. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3.11. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 64 Hình 3.12. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ Agrobacterium 65 Hình 3.13. Quá trình tạo dòng tế bào thuốc lá BY2 mang gen miraculin 67 Hình 3.14. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng BY2 bằng kỹ thuật PCR 68 viii Hình 3.15. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculin trong một số dòng tế bào BY2 chuyển gen 70 Hình 3.16. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng BY2 chuyển gen 71 Hình 3.17. Quá trình tạo và chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin 73 Hình 3.18. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng rễ tơ bằng kỹ thuật PCR 74 Hình 3.19. Hình ảnh chiều dài của một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen. 74 Hình 3.20. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculintrong một số dòng rễ tơ 78 Hình 3.21. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng rễ tơ chuyển gen 79 Hình 3.22. Quá trình tạo và sàng lọc cà chua chuyển gen miraculin 82 Hình 3.23. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR 83 Hình 3.24. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra sự biểu hiện mRNA của gen chuyển miraculin trong các dòng cà chua 84 Hình 3.25. Hình ảnh xác định số bản copy trong các dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật Southern Blot 86 Hình 3.26. Hình ảnh dòng cà chua chuyển gen ngoài tự nhiên 88 Hình 3.27. Quả cà chua giai đoạn chín đỏ 89 Hình 3.28. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp ở vỏ ngoài quả cà chua chuyển gen 89 ix DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT µg microgam 3‟UTR, 5‟ UTR Vùng 3' hoặc 5‟ không dịch mã 35S Promoter CaMV35S AS Acetosyringone Asn Asparagine BAP Benzylaminopurine bp Base pair BY2 Bright Yellow2 cDNA Complementary DNA CTAB Hexadecyltrimethyl ammonium bromide Cys Cysteine DEPC Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli E8-pro Promoter E8 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay HRP Horseradish Peroxidase HSE Heat shock Element HSP Heat shock protein HSP-pro Promoter HSP 18.2 HSP-ter Terminator HSP 18.2 IAA Indole Acetic acid kb Kilobase kDa Kilodalton x LB Biên trái (left T-DNA border) mg miligam mg/l hoặc mg/ml miligam/lít hoặc miligam/mililít MIR Protein miraculin ml mililít Môi trƣờng LB Môi trƣờng Luria và Bertani MS Murashige và Skoog NAA Naphthaleneacetic acid ng nanogam NOS nopaline synthase gen NOS-ter Terminator nopaline synthase gene NptII (kana r ) Gen kháng kanamycin PCR Polymerase Chain Reaction PCS Polycloning site RB Biên phải (right T-DNA border) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine v/p vòng/phút WT Wild type ZR Zeatin riboside 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, các chất làm ngọt nhân tạo nhƣ saccharin, aspartame, sucralose và acesulfame-K đƣợc con ngƣời sử dụng phổ biến nhƣ những chất làm ngọt ít năng lƣợng, nhằm giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính liên quan đến đƣờng nhƣ béo phì, đái tháo đƣờng. Tuy nhiên, một số hợp chất này có thể gây ung thƣ (Kant 2005). Trong tự nhiên, có rất nhiều loại protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt đã đƣợc phát hiện bao gồm thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin, brazzein, neoculin (curculin) và miraculin. Các protein này có thể đƣợc sử dụng để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo bởi vì chúng tạo vị ngọt cho ngƣời sử dụng, an toàn do có nguồn gốc tự nhiên và ít sinh năng lƣợng. Tuy nhiên, sản lƣợng tự nhiên của các protein này bị hạn chế do hầu hết các protein này thu đƣợc từ cây sống ở vùng nhiệt đới, nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt (Kant 2005). Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu biểu hiện thành công một số protein ngọt và tạo vị ngọt nhƣ thaumatin, monellin, brazzein và miraculin ở quy mô phòng thí nghiệm trong một số hệ thống biểu hiện nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm, tế bào BY2, hệ thống nuôi cấy rễ tơ và cây trồng chuyển gen (Masuda, Kitabatake 2006, Pham Bich Ngoc 2009). Tuy nhiên, mức độ tích lũy của các protein tái tổ hợp này khá thấp, dẫn đến các nghiên cứu về protein ngọt và protein tạo vị ngọt đều chƣa thể sản xuất thƣơng mại các sản phẩm tái tổ hợp. Miraculin là một trong số các protein tạo vị ngọt, có trong quả của cây thần kỳ (Richadella dulcifica), có đặc tính tạo ra cảm giác ngọt để thay đổi từ vị chua thành cảm giác ngọt mà bản chất của miraculin là không ngọt. Tính chất độc đáo này của miraculin rất có ích cho con ngƣời nhằm ngăn ngừa các căn bệnh hiện đại do các chất làm ngọt nhân tạo gây ra. Miraculin cũng là chất ít sinh năng lƣợng. Do 2 vậy, có thể sử dụng miraculin để thay thế đƣờng, giúp ngƣời sử dụng tránh đƣợc các nguy cơ mắc bệnh béo phì. Với tính chất độc đáo nhƣ vậy, xong sản lƣợng của miraculin trong tự nhiên bị hạn chế do cây thần kỳ sinh trƣởng chậm ở nơi khí hậu khắc nghiệt của Tây Phi. Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm sản xuất miraculin tái tổ hợp trên một số đối tƣợng khác nhau. Tuy nhiên, mức độ tích lũy của miraculin tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện vẫn chƣa đƣợc nhƣ kỳ vọng. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thay đổi mã di truyền gen miraculin của cây thần kỳ, thiết kế vector chuyển gen cùng với các promoter đặc hiệu và promoter cảm ứng để chuyển vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua nhằm thu đƣợc các dòng chuyển gen có khả năng biểu hiện miraculin tái tổ hợp. 3. Nội dung nghiên cứu 1) Thay đổi mã di truyền của gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà. Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ