Luận án Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------- TRẦN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ (Hericium erinaceus) VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes) NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, 2015 ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng anh Tiếng việt AST Serum aspartat transaminase ALT Serum alanin transaminase ATCC American Type Culture Collection Ngân hàng chủng giống Mỹ BC Bạch cầu BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 CC Column Chromatography Sắc kí cột CCT Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng COSY Correlation Spectroscopy Phổ COSY CS% Cell survival % % tế bào sống sót DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT DEAE- cellulose cellulose Diethylaminoethyl DMSO Dimethyl sulfoxid Dimetyl sulfoxit EAC Ehrlich ascites Carcinoma Ung thư cổ trướng ECACC The European Collection of Cell Cultures Ngân hàng chủng giống châu Âu ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectra Phổ khối ion hóa phun mù điện tử EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat FBS Foetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò Fl Human cervical uterine carcinoma Tế bào Ung thư tử cung GC Gas Chromatography Sắc kí khí iii γGT Serum gamma glutanin transaminase Hb Haemoglobin HC Hồng cầu Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC High Performance liquid Chromatography Sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao HSQC Heteronuclear single-Quantum Conherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% KLT Khối lượng tạng KN Kháng nguyên LD50 lethal dose 50% Liều gây chết 50% động vật thực nghiệm Lu Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư biểu mô phổi MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NC Nghiên cứu OD Optical Density Mật độ quang OVA Ovalbumin Albumin lòng trắng trứng PBS Phosphat buffer saline Dung dịch đệm phosphat RD Human Rhabdomyosarcoma Ung thư mô liên kết SC% % scavenging capacity % khả năng trung hòa gốc tự do SGMD Suy giảm miễn dịch SRB Sulforhodamine B TCA Trichloacetic acid Axit tricloaxetic TCCS Tiêu chuẩn cơ sở iv TCL Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TL (g) Trọng lượng (gam) TLCT Trọng lượng cơ thể TNFα Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử ung thư VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới v MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .............................................. ii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ......................................................................... xiii MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Nấm dược liệu và ứng dụng trong y học dân tộc ............................................ 3 1.1.1. Giới thiệu về nấm dược liệu ........................................................................ 3 1.1.2. Ứng dụng trong y học dân tộc..................................................................... 4 1.2. Những nghiên cứu trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học của nấm dược liệu .................................................................................................................. 6 1.2.1. Các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ............................................................ 6 1.2.1.2. Các chất có hoạt tính sinh học khác ......................................................... 11 1.2.2. Hoạt tính của polysaccharide từ nấm dược liệu ......................................... 19 1.3. Tình hình nghiên cứu về nấm hầu thủ và nấm hương ................................... 30 1.3.1. Nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) .......................................................... 30 1.3.1.1. Trên thế giới ........................................................................................... 30 1.3.1.2. Ở Việt Nam ............................................................................................ 34 1.3.2. Nấm hương (Lentinus edodes). ................................................................. 35 1.3.2.1. Trên thế giới ........................................................................................... 36 1.3.2.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 40 1.4. Mô hình nuôi cấy tế bào ung thư ba chiều (3D) trong nghiên cứu ung thư ... 41 CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 44 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 44 2.1.1. Nấm hương ................................................................................................ 44 2.1.2. Nấm hầu thủ .............................................................................................. 44 2.2. Dụng cụ, hóa chất và môi trường .................................................................. 44 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 44 2.2.2. Môi trường ................................................................................................ 44 2.3. Các phương pháp phân lập các hợp chất ....................................................... 45 vi 2.4. Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ ................... 46 2.4.1. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương.................................... 46 2.4.2. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ .................................. 46 2.5. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học .................................................. 46 2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide ......................................... 46 2.7. Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3-glucanase ...................................................................................................... 47 2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan ................................ 47 2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học....................................................... 48 2.9.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) ........................... 48 2.9.2. Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro ....................................................................................... 50 2.10. Các phương pháp thử dược lý ...................................................................... 51 2.10.1. Phương pháp đánh giá độc tính cấp ........................................................... 51 2.10.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn ...................................... 51 2.10.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm .............................. 52 2.10.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid ...................................................................................... 52 2.10.3.2. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn ................................................................................. 52 2.10.3.3. Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm ............. 52 2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm .................................... 52 2.10.4. Xử lý số liệu ............................................................................................... 52 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ........................................................................... 53 3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương ............................ 53 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương ............................................. 53 3.1.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương ...................................... 55 3.1.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hương 55 vii 3.1.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương (sơ đồ 3.3) ................ 56 3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ .......................... 57 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ (sơ đồ 3.4) .......................... 57 3.2.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ .................................... 60 3.2.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hầu thủ 60 3.2.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ ................................................. 61 3.2.5. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzyme - 1,3-glucanase ......................................................................................................... 62 3.2.6. Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin .......... 64 3.3. Tạo chế phẩm thử nghiệm .............................................................................. 66 3.4. Thử dược lý chế phẩm .................................................................................... 66 3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp .............................................................................. 66 3.4.3. Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm 68 3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm HG2....70 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 73 4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương ............................ 73 4.1.1. Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học ................................... 73 4.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3 ................................. 76 4.1.2.1. Hợp chất NH1: galactiol ........................................................................ 76 4.1.2.2. Hợp chất NH-2: Ergosterol .................................................................... 80 4.1.2.3. Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide ...................................................... 84 4.1.2.4. Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan (lentinan) ...................................... 88 4.1.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương .... 89 4.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ .......................... 92 4.2.1. Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư ................................ 92 4.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ ............................ 94 viii 4.2.2.1. Hợp chất HT1: axit stearic ........................................................................ 94 4.2.2.2. Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide ......................................................... 97 4.2.2.3. Hợp chất HT3 - Cerebroside B ................................................................. 99 4.2.2.4. Hợp chất HT4 - Hericenone D ............................................................... 104 4.2.2.5. Hợp chất HT5 - Ergosterol .................................................................... 110 4.2.2.6. Hợp chất HT6 - β-Adenosine ................................................................. 112 4.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ ... 118 4.3. Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan hơn và đánh giá hoạt tính của chúng .......................................................................... 121 4.3.1. Thủy phân bằng enzyme -1,3-glucanase ................................................. 122 4.3.2. Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin ............. 124 4.4. Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm...128 4.4.1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống của chế phẩm HG1 ............................................................................................................ 128 4.4.2. Độc tính bán trường diễn của sản phẩm HG1 khi cho uống trên động vật thực nghiệm ......................................................................................................... 129 4.4.2.1. Ảnh hưởng của HG1, cho CNT uống trường diễn đối với khối lượng gan, lách, thận động vật ............................................................................................... 130 4.4.2.2. Kết quả nghiên cứu trọng lượng cơ thể CNT, khối lượng gan, lách, thận và tỷ số giữa khối lượng mỗi tạng so với trọng lượng cơ thể ............................. 131 4.4.2.3. Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêu huyết học trên động vật thực nghiệm ............................................................................ 132 4.4.2.4. Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số hóa sinh động vật khi cho uống bán trường diễn ........................................................................................... 133 4.4.2.5. Ảnh hưởng của sản phẩm dùng uống 6 tuần đến chức năng tim thỏ được đo điện tim ........................................................................................................... 134 4.4.2.6. Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số mô bệnh học khi dùng trường diễn....................................................................................................................... 135 4.4.3. Kết quả nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 ......................... 136 ix 4.4.3.1. Tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm trên chuột nhắt được gây độc gan bằng carbon tetraclorid ........................................................................................ 136 4.4.3.2. Ảnh hưởng của sản phẩm uống bán trường diễn đến quá trình tổng hợp protein trên động vật thực nghiệm ....................................................................... 137 4.4.3.3. Tác dụng trên hệ miễn dịch của sản phẩm ............................................. 138 4.4.3.4. Kết quả đánh giá tỷ lệ sống/chết của CNT sau chiếu xạ dưới tác dụng của sản phẩm .............................................................................................................. 139 4.4.3.5. Kết quả nghiên cứu tác dụng tên các dòng tế bào có chức năng miễn dịch ............................................................................................................................. 140 4.4.3.6. Kết quả nghiên cứu về phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu dưới tác dụng của sản phẩm ........................................................................ 141 4.4.4. Thử nghiệm tác dụng của sản phẩm HG1 lên tế bào ung thư ................... 144 4.4.4.1. Tác dụng của sản phẩm HG1 lên hồng cầu và tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) in vitro ............................................................................. 144 4.4.4.2. Tác dụng của hỗn hợp HG1 lên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) in vivo ...................................................................................................... 144 4.4.4.1. Tác dụng của chế phẩm HG1 lên khối tế bào ung thư Ehrlich in vivo .. 144 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 147 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 149 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............... 150 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 152 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC .............................. Error! Bookmark not defined. x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách nấm dược liệu tiêu biểu và đặc tính chữa bệnh ..................... 5 Bảng 1.2. Các chất phân tử lượng nhỏ có hoạt tính kháng u .................................. 9 Bảng 1.3. Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dược liệu19 Bảng 1.4. Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide .............. 28 Bảng 1.5. Giá trị y học và một số chất hoạt tính từ nấm hương ............................ 37 Bảng 3.1. Kết quả thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzym -1,3-glucanase .......................................................................................... 63 Bảng 4.1. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương ................. 73 Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết của nấm hương ........................ 74 Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polysaccharide .............................................................................................. 74 Bảng 4.4. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn ............................................... 75 Bảng 4.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn ........................................................................................................................ 76 Bảng 4.6. Kết quả phổ 13C- NMR của NH2 .......................................................... 83 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất NH3 và hợp chất tham khảo ............... 86 Bảng 4.8. So sánh phổ 13C-NMR của lentinan và β-1,3/1,6 tinh sạch .................. 89 Bảng 4.9. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương ..... 90 Bảng 4.10. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan Hep-G2 trên thạch mềm của các hợp chất ........................................................................... 91 Bảng 4.11. Hàm lượng polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ và nấm hương .................................................................................................. 92 Bảng 4.12. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn chiết tách từ nấm hầu thủ .... 93 Bảng 4.13. Hoạt tính kháng u trên thạch của các cặn chiết nấm hầu thủ .............. 94 Bảng 4.14. Kết quả phổ NMR của HT3 .............................................................. 103 Bảng 4.15. Kết quả phổ NMR của HT4 .............................................................. 107 Bảng 4.16. Kết quả phổ NMR của HT6 .............................................................. 113 Bảng 4.17. giá trị tín hiệu phổ 13C-NMR của -1,3/1,6 glucan hầu thủ ............ 118 xi Bảng 4.18. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ119 Bảng 4.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2 trên thạch mềm của các hợp chất ......................................................................... 120 Bảng 4.20. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác nhau. ............................................................................................... 123 Bảng 4.21. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β- 1,3/1,6-glucan có trọng lượng phân tử khác nhau ............................................... 124 Bảng 4.22. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các sản phẩm trên dòng tế bào HepG2................................ 128 Bảng 4.23. Độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống trên CNT ................... 129