Luận án Nghiên cứu chọn giống bạch đàn có khả năng chịu mặn để trồng rừng ven biển

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THẾ HƢỞNG NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN ĐỂ TRỒNG RỪNG VEN BIỂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LÂM NGHIỆP Hà Nội, 2017 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THẾ HƢỞNG NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN ĐỂ TRỒNG RỪNG VEN BIỂN Chuyên ngành: Lâm sinh Mã số: 62.62.02.05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ LÂM NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1. PGS.TS. BÙI THẾ ĐỒI 2. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ Chữ ký duyệt của ngƣời hƣớng dẫn Hƣớng dẫn 1 Bùi Thế Đồi Hƣớng dẫn 2 Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2017 - ii - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án tiến sĩ Lâm nghiệp ―Nghiên cứu chọn giống Bạch đàn có khả năng chịu mặn để trồng rừng ven biển” thuộc chuyên ngành lâm sinh - mã số 62.62.02.05 là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Tôi cũng cam đoan số liệu cũng nhƣ kết quả nghiên cứu trong Luận án là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác dƣới mọi hình thức. Cuối cùng, tôi xin chịu trách nhiệm trƣớc Hội đồng bảo vệ luận án tiến sĩ về lời cam đoan của bản thân. Hà Nội, tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Thế Hƣởng - iii - LỜI CẢM ƠN Luận án tiến sĩ “Nghiên cứu chọn giống Bạch đàn có khả năng chịu mặn để trồng rừng ven biển” thuộc chuyên ngành Lâm sinh - mã số 62.62.02.05 là công trình nghiên cứu về lĩnh vực chọn – tạo giống cây trồng lâm nghiệp có sức chống chịu bằng phƣơng pháp chọn - tạo kết hợp với công nghệ nuôi cấy mô – tế bào. Trong quá trình thực hiện, với sự nỗ lực của bản thân và sự giúp đỡ tận tình của các nhà khoa học, các đồng nghiệp và gia đình, đến nay, luận án đã đƣợc hoàn thành. Nhân dịp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai thầy hƣớng dẫn là PGS.TS. Bùi Thế Đồi và PGS.TS. Chu Hoàng Hà cùng các chuyên gia nhƣ: TS. Bùi Văn Thắng, PGS. TS Hà Văn Huân, TS. Nguyễn Văn Việt cũng nhƣ nhiều nhà khoa học khác đã giúp đỡ tác giả hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn tới các đơn vị trong Trƣờng Đại học Lâm nghiệp bao gồm: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Viện Sinh thái rừng và Môi trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Bộ môn Lâm sinh – khoa Lâm học ... đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả thực hiện luận án. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới toàn thể gia đình cũng nhƣ những ngƣời thân đã luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi về vật chất, tinh thần cho tác giả trong suốt thời gian thực hiện luận án. Xuân Mai, tháng năm 2017 Nguyễn Thế Hƣởng - iv - CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Giải thích 1 ADN Axit deoxiribonucleic 2 AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism 3 ATPase (ATP) Adenosine 5’ - triphosphatase 4 CAM Crassulacean acid metabolism 5 CBF CRT binding factor (protein bám CRT) 6 CDPK calcium - dependent protein kinase (ptotein phụ thuộc canxi) 7 CNSH Công nghệ sinh học 8 COR Cold-regulated – Gen chịu lạnh 9 CRT C-repeat (vùng ADN gồm toàn các nucleotide loại C đƣợc lặp nhiều lần) 10 CRT/DRE C-repeat/dehydration-responsive element (tổ hợp C - lặp lại/ yếu tố đáp ứng sự mất nƣớc) 11 CSIRO Commonwealth Scientific & Industrial Research Organization (Tổ chức nghiên cứu khoa học & công nghiệp của khối Thịnh vƣợng chung) 12 CWPDP Dự án Bảo vệ và phát triển các vùng đất ngập nƣớc ven biển miền Nam Việt Nam 13 D00(mm) Đƣờng kính gốc 14 D1.3 (cm) Đƣờng kính ngang ngực 15 DUS Distinctness Uniformity Stability (khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của giống mới) - v - 16 DNA (AND) Deoxyribonucleic acid 17 ĐC Đối chứng 18 FORTIP Forest tree improvement (dự án cải thiện cây rừng) 19 Gy (gray) Đơn vị đo lƣờng phóng xạ 20 Hdc (m) Chiều cao dƣới cành 21 Hvn (m, cm) Chiều cao vút ngọn 22 LEA Protein Late Embryogenesis Abundant 23 NaCl Muối natriclorid 24 ND Nƣớc dừa 25 NST Nhiễm sắc thể 26 OTC Ô tiêu chuẩn 27 P5CS Enzym Pyroline - 5 - carboxylate synthase 28 QTL Quantitative Trait Locus (nhóm gen quy định tính trạng) 29 Rad Đơn vị đo lƣờng phóng xạ (1 Rad = 10-2 Gy) 30 RAPD Random amplified polymorphic DNA (sự đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên) 31 RFLP Restriction fragment length polymorphism (đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) 32 ROS Reactive oxygen species (Gốc ô xi hóa tự do ) 33 RUBISCO Enzym ribuloso - 1,5 biphosphat cacboxylaza - oxygenaza 34 S (ha, m 2 , mm 2 ) Diện tích 35 SI Hệ đơn vị đo lƣờng quốc tế - vi - 35 SSR Simple sequence repeats (các trình tự lặp lại đơn giản) 36 TK Tiểu khu - vii - MỤC LỤC TT Trang TRANG PHỤ BÌA. LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iii LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. iii CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................................. iv MỤC LỤC ....................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... xi DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. xiii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Sự cần thiết của luận án................................................................................. 1 2. Mục tiêu của luận án ..................................................................................... 2 2.1. Mục tiêu chung ........................................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................... 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của luận án ............................................. 3 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................. 3 3.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................... 3 4 . Những đóng góp mới của luận án ................................................................ 3 4.1. Về phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 3 4.2. Về cơ sở lý luận và khoa học ..................................................................... 4 4.3. Về kết quả và kết luận ................................................................................ 5 5. Kết cấu chung của luận án ............................................................................ 5 - viii - Chƣơng 1 ........................................................................................................... 6 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................................................... 6 1.1. Đất nhiễm mặn và cơ chế chịu mặn của thực vật ..................................... 6 1.1.1. Khái niệm về đất nhiễm mặn .................................................................. 6 1.1.2. Cơ chế chịu mặn của thực vật ................................................................. 6 1.2. Cơ sở khoa học của chọn, tạo giống bằng phƣơng pháp gây đột biến nhân tạo 13 1.2.1. Khái niệm đột biến ................................................................................ 13 1.2.2. Khái niệm biến dị dòng soma ............................................................... 13 1.2.3. Tạo biến dị soma bằng phƣơng pháp chiếu xạ ...................................... 14 1.2.4. Phƣơng pháp xử lý phóng xạ trong nghiên cứu tạo dòng biến dị soma 16 1.2.5. Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử ......... 17 1.2.6. Tác động của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền cở cấp độ tế bào .. ........................................................................................................... 17 1.2.7. Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật .......................................... 19 1.3. Kỹ thuật phân tích sai khác di truyền bằng RAPD .................................. 20 1.4. Tổng quan các vấn đề nghiên cứu ............................................................ 21 1.4.1. Trên Thế giới ......................................................................................... 21 1.4.2. Ở Việt nam ............................................................................................ 30 1.5. Những nhận định ...................................................................................... 41 Chƣơng 2 ......................................................................................................... 44 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 44 - ix - 2.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 44 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 44 2.2.1. Phƣơng pháp luận .................................................................................. 44 2.2.2. Tuyển chọn cây trội ............................................................................... 45 2.2.3. Thu hái và bảo quản vật liệu giống ....................................................... 49 2.2.4. Chọn dòng Bạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn .. 49 2.2.5. Gây đột biến nhân tạo và chọn dòng Bạch đàn mang đột biến nhân tạo có khả năng chịu mặn ...................................................................................... 51 2.2.6. Đánh giá sự sai khác về đặc điểm sinh trƣởng, hình thái, cấu tạo giải phẫu lá và di truyền của các dòng Bạch đàn đã chọn đƣợc ở giai đoạn vƣờn ƣơm 54 2.3. Phân tích và xử lý số liệu ......................................................................... 58 Chƣơng 3 ......................................................................................................... 61 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................................. 61 3.1. Tuyển chọn cây trội Bạch đàn .................................................................. 61 3.1.1. Kết quả điều tra sơ thám xác định địa điểm chọn lọc cây trội .............. 61 3.1.2. Kết quả điều tra đặc điểm lâm phần chọn lọc cây trội .......................... 62 3.1.3. Kết quả đánh giá cây trội theo các chỉ tiêu sinh trƣởng ........................ 67 3.2. Chọn dòng Bạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn ..... 70 3.2.1. Khả năng tạo chội của các dòng Bạch đàn urô trong các môi trƣờng có bổ sung muối ................................................................................................... 70 3.2.2. Khả năng ra rễ của các dòng Bạch đàn urô trong các môi trƣờng có bổ sung muối ........................................................................................................ 77 - x - 3.3. Gây đột biến mô sẹo bằng tia gamma và sàng lọc tái sinh trên môi trƣờng mặn nhân tạo ................................................................................................... 81 3.3.1. Ảnh hƣởng của liều lƣợng chiếu xạ tia gamma đến hiệu quả tạo dòng đột biến chịu mặn ............................................................................................ 81 3.3.2. Khả năng ra rễ của các dòng Bạch đàn urô mang biến dị soma ở các môi trƣờng có bổ sung muối ........................................................................... 92 3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng Bạch đàn đã chọn, tạo ở giai đoạn vƣờn ƣơm trong các môi trƣờng có bổ sung muối. ......................... 94 3.5. Sự sai khác về đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu lá và di truyền của các dòng Bạch đàn có khả năng chịu mặn đã chọn ở vƣờn ƣơm. ................... 97 3.5.1. So sánh sự sai khác về đặc điểm hình thái lá ........................................ 97 3.5.2. Đánh giá sự sai khác về cấu tạo giải phẫu lá ...................................... 101 3.5.3. Sự sai khác về di truyền ...................................................................... 103 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................. 109 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ ............................................. 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 113 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 128 - xi - DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Trình tự nucleotit của các mồi sử dụng trong phân tích RAPD ..... 58 Bảng 3.1. Tổng hợp số lƣợng lâm phần Bạch đàn urô ở các xã huyện Lộc Hà – Hà Tĩnh ............................................................................................. 62 Bảng 3.2. Một số tính chất của đất ở các OTC thuộc các lâm phần ............... 63 Bảng 3.3. Đặc điểm sinh trƣởng Bạch đàn ở các lâm phần chọn lọc cây trội 65 Bảng 3.4. Đánh giá cây trội theo các chỉ tiêu sinh trƣởng .............................. 69 Bảng 3.5. Tỷ lệ tái sinh chồi của các dòng Bạch đàn ở các công thức thí nghiệm ................................................................................................. 71 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phƣơng sai 2 nhân tố ......................................... 72 về tỷ lệ chồi tái sinh của Bạch đàn .................................................................. 72 Bảng 3.7. Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) của 5 dòng đƣa vào đánh giá ........................ 78 trong môi trƣờng ra rễ chứa 125 mM/l NaCl .................................................. 78 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma đến khả năng tái sinh chồi của mô sẹo Bạch đàn trên các môi trƣờng chọn lọc ........................... 82 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phƣơng sai 2 nhân tố theo các chỉ tiêu .............. 83 Bảng 3.10. Khả năng ra rễ của các dòng chịu mặn trên môi trƣờng muối nhân tạo ........................................................................................................ 92 Bảng 3.11. Sinh trƣởng các dòng chịu mặn và đối chứng .............................. 94 Bảng 3.12. Hình thái lá các dòng chịu mặn và đối chứng .............................. 98 Bảng 3.13. Số lƣợng khí khổng các dòng chịu mặn và đối chứng ............... 101 - xii - Bảng 3.14. Kết quả phân tích PCR-RAPD của mồi CP03 và CP07 đối với các dòng Bạch đàn (trong đó + là xuất hiện và – là không xuất hiện băng) ........................................................................................................... 103 Bảng 3.15. Đặc trƣng phân tử có ý nghĩa nhận dạng di truyền giữa các dòng chịu mặn và đối chứng dựa trên chỉ thị RAPD ................................. 106 - xiii - DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thực hiện đề tài ...................................................... 48 Hình 2.2. Sơ đồ các bƣớc tái sinh Bạch đàn thông qua mô sẹo ...................... 52 Hình 3.1. Đƣờng kính ngang ngực ở các OTC ............................................... 66 Hình 3.2. Chiều cao vút ngọn ở các OTC ....................................................... 66 Hình 3.3. Chiều cao dƣới cành ở các OTC ..................................................... 67 Hình 3.4. Thể tích thân cây trung bình ở các OTC ......................................... 67 Hình 3.5. Ảnh các cây trội đƣợc lựa chọn ...................................................... 70 Hình 3.6. Tỷ lệ tái sinh của các dòng Bạch đàn ở các công thức thí nghiệm về nồng độ muối ...................................................................................... 72 Hình 3. 7. Chồi của 5 dòng Bạch đàn(D1, D4, D7, D23, D29) tái sinh trên môi trƣờng NT3 .......................................................................................... 76 Hình 3.8. Cụm chồi của 5 dòng Bạch đàn (D1, D4, D7, D23, D29) trên môi trƣờng NT3 .......................................................................................... 77 Hình 3.9. Tỷ lệ ra rễ của các dòng Bạch đàn .................................................. 79 Hình 3.10. Số rễ trung bình/cây của các dòng Bạch đàn ................................ 79 Hình 3.11. Chiều dài rễ trung bình của các dòng Bạch đàn ........................... 79 Hình 3.12. Các dòng Bạch đàn chịu mặn trên môi trƣờng ra rễ RT3 ............. 80 Hình 3.13. Tỷ lệ sống của mô sẹo ở các liều lƣợng chiếu .............................. 85 và môi trƣờng chọn lọc ................................................................................... 85 Hình 3.14. Tỷ lệ tái sinh của mô sẹo ở các liều lƣợng chiếu .......................... 88 - xiv - và môi trƣờng chọn lọc ................................................................................... 88 Hình 3.15. Số chồi trung bình/mô sẹo ở các liều lƣợng chiếu ........................ 88 và môi trƣờng chọn lọc ................................................................................... 88 Hình 3.16. Mô sẹo trƣớc khi đem chiếu xạ ..................................................... 91 Hình 3.17. Mô sẹo chiếu xạ ở các liều lƣợng chiếu trên các môi trƣờng chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy. ....................................................................... 91 Hình 3.18. Cây hoàn chỉnh dòng LH01 .......................................................... 93 trên môi trƣờng mặn nhân tạo 125 mM/l NaCl............................................... 93 Hình 3.19. Các dòng Bạch đàn ở giai đoạn vƣờn ƣơm ................................... 97 Hình 3.20. Lá dòng đối chứng và dòng LH01 .............................................. 100 Hình 3.21. Cấu tạo giải phẫu lá dòng ĐC và dòng LH04 ............................. 103 Hình 3.22. Sản phẩm PCR của 02 cặp mồi CP03 và CP07 .......................... 104 Hình 3.23. Sản phẩm PCR với mồi CP05 điện di trên gel agarose 1,8 % .... 107 Hình 3.24. Sản phẩm PCR với mồi CP11 điện di trên gel agarose 1,8 % .... 108 - 1 - MỞ ĐẦU 1. Sự cần thiết của luận án Trong những năm gần đây, vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu đang là một bài toán khó đối với nhiều nƣớc trên thế giới. Ở Việt Nam, biến đổi khí hậu gây ảnh hƣởng nặng nề đến nhiều ngành, nhiều lĩnh vực. Trong đó, ngành lâm nghiệp là một trong những ngành chịu ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi những tác động của hiện tƣợng này. Một trong số những mặt đó là diện tích đất nhiễm mặn ngày càng tăng cao theo kịch bản nƣớc biển dâng. Theo thống kê, năm 2000, ở Việt Nam có diện tích khoảng 2 triệu ha đất bị nhiễm mặn, chiếm khoảng 6% diện tích đất tự nhiên của cả nƣớc, tập trung chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và các tỉnh ven biển từ Quảng Bình trở ra. Các địa bàn bị mặn xâm nhập vào sâu trong nội đồng từ 30 – 40 km (Lê Văn Khoa và cs, 2000) [23]. Đến năm 2016, có nơi tới 90 km nhƣ khu vực sông Vàm Cỏ (các tỉnh Long An, Tiền Giang và Bến Tre) với độ mặn ở mức 2 - 4 g/l đối với độ sâu vào đất liền từ 40 – 50 km và 1 - 2 g/l đối với độ sâu vào đất liền khoảng 80 km (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2016) [3]. Đất nhiễm mặn là loại đất có chứa nhiều cation Na+ hấp phụ trên bề mặt keo đất và trong dung dịch đất. Đất nhiễm mặn chứa nhiều muối tan dƣới dạng NaCl hoặc Na2SO4, thƣờng có áp suất thẩm thấu rất cao nên phần lớn các loài cây trồng không thể hút đƣợc nƣớc và chất dinh dƣỡng dẫn đến hiện tƣợng hạn sinh lý và chết. Bình thƣờng, thực vật không thể sống trong môi trƣờng có áp suất thẩm thấu vƣợt quá ngƣỡng 40 atm. Vì vậy, diện tích đất nhiễm mặn hiện nay phần lớn đã bị bỏ hoang, một số ít đƣợc dùng để trồng các loài cây có cơ chế thích nghi với đất mặn nhƣ: Đƣớc, Bần, Vẹt, Sú, Trang, Phi lao, Tràm.....và một số ít đƣợc cải tạo để sử dụng theo các hình t