Luận án Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG TÔN QUYỀN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU VỚI SỰ TRỢ GIÚP CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà nội - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG TÔN QUYỀN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU VỚI SỰ TRỢ GIÚP CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số : 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Vũ Đức Quang TS Lưu Thị Ngọc Huyền Hà nội - 2014 i L()I C A M DOAN 'I6i xin cam doan day la kct qua cong tiinh nghicn cu'u cua loi . Toan bo so Hcu va kct qua nghicn cu'u trong luan an nay la trung thyc va chua tirng dugc su dung dc cong bo Irong cac cong trinh nghicn cuu de nhan hoc v i , cac thong tin trich dan trong luan an nay deu dugc chi ro nguon goc. Ha noi, ngay 22 thang 5 nam 2014 ac g aluan an f\ Phung Ton Quyen ii LOI C A M ON Tru'dc hel loi xin dugc gui loi biel an sau sac den P G S . T S . V u Du'c Quang, rS. Lu'u I'hi Ngoc Iluyen, V ien D i Iruycn Nong nghicp, da tan tinh hu'o'ng dan giiip da va tao dicu kicn thuan Igi dc loi hoan thanh cong trinh nghicn cu'u nay. l o i xin chan thanh cam an tap the lanh dao va can bg Ban dao tao sau dai hgc, V i c n K h o a hgc Nong nghicp Vic t Nam, Ban giam hieu nha truang va Khoa C N S I l & M T, lYuang Dai hgc Phuang Dong, da tao mgi dicu kien thuan Igi cho toi hoan thanh nhicm vu. I 01 xin chan thanh cam on tap the can bg nhan vicn B g mon Sinh hgc Phan lu', V i c n Di truycn Nong nghicp, noi toi da sinh boat chuyen mon, da tao mgi dicu kicn tot nhat cho toi hgc tap va nghicn CLTU. I oi xin dugc cam an sy quan tarn chia se va dgng vicn, tir gia dinh, ban be va nguoi than. Ha noi, ngay 22 thdng 5 nam 2014 Phung Ion Quyen iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i LỜI CẢM ƠN......................................................................................................ii MỤC LỤC........................................................................................................iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................viii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................x DANH MỤC CÁC HÌNH...............................................................................xii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………...1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài : ...................................................................................... 2 3. Thời gian và địa điểm thực hịên đề tài: ......................................................... 3 4. Tính mới và những đóng góp của đề tài: ..................................................... 3 5. Ý nghĩa của đề tài: ......................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Rầy nâu và đặc tính kháng rấy nâu ở lúa ................................................... 4 1.1.1. Đặc tính sinh học của rầy nâu ................................................................. 4 1.1.1.1. Phân bố và ký chủ ................................................................................ 5 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của rầy nâu ............................................................ 5 1.1.1.3. Tình hình và mức độ gây hại ............................................................... 9 1.1.1.4. Phòng trừ rầy nâu ............................................................................... 11 1.1.2. Đặc tính kháng rầy nâu ở lúa: ............................................................... 12 1.1.2.1. Cơ chế tính kháng đối với côn trùng .................................................. 12 1.1.2.2. Các kiểu sinh học (BPH) rầy nâu ...................................................... 14 1.1.2.3. Di truyền tính kháng rầy nâu ở lúa..................................................... 16 1.2. Chỉ thị phân tử và những ứng dụng trong chọn tạo giống lúa ................. 18 1.2.1. Chỉ thị phân tử ....................................................................................... 18 1.2.1.1. Khái niệm chung về chỉ thị phân tử ................................................... 18 1.2.1.2. Phân loại các loại chỉ thị phân tử ....................................................... 20 iv 1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa ........... 26 1.2.2.1. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử .......................................................... 26 1.2.2.2. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu lập bản đồ QTL/gen ..................... 29 1.2.2.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền gen kháng rầy nâu……..37 1.2.2.4. Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu tại Việt Nam. 50 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 55 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 55 2.1.1. Các dòng/giống lúa làm vật liệu nghiên cứu………………………….55 2.1.2. Nguồn gốc các dòng/giống lúa làm vật liệu nghiên cứu………...……55 2.1.2.1. Dòng/giống lúa cho gen kháng rầy nâu (donor)……………..….......55 2.1.2.2. Giống nhận gen (recipient) ....................................................................................59 2.1.3. Các nguyên vật liệu phục vụ nghiên cứu…………………………….60 2.1.3.1. Các chỉ thị phân tử SSR liên kết gen Bph3 và BphZ(t) ………..…..60 2.1.3.2. Nguồn rầy nâu ………………………………………………..…….61 2.1.3.3. Thiết bị, vật tư hóa chất………………………………………..……61 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 62 2.2.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng/nhiễm rầy nâu các dòng/giống lúa ... 62 2.2.2. Phương pháp lai hồi giao, qui tụ gen kháng rầy .................................. 63 2.2.3. Phương pháp thu thập thông tin các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu. 65 2.2.4. Phương pháp chọn tạo dòng lúa kháng rầy nâu bằng chỉ thị phân tử ... 65 2.2.4.1. Chọn tạo dòng lúa ưu tú từ quần thể phân ly (F2 trở đi đến F6) ......... 65 2.2.4.2. Chọn tạo các dòng lúa ưu việt trên cơ sở hồi giao . ........................... 65 2.2.5. Một số kỹ thuật dùng trong phòng thí nghiệm ..................................... 65 2.2.5.1.Tách chiết ADN và tinh sạch theo phương pháp CTAB .................... 65 2.2.5.2. Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agorose 0.8%............................68 2.2.5.3. Kỹ thuật PCR………………………………………………………..69 2.2.5.4. Kỹ thuật làm gel và điện di kiểm tra sản phẩm Gel Agarose…..….70 2.2.6. Chọn giống truyền thống: ..................................................................... 72 2.2.6.1. Cơ sở lý luận: ..................................................................................... 72 v 2.2.6.2. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng ................................................. 74 2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ................................................... 77 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 78 3.1. Nghiên cứu nguồn vật liệu và tập đoàn dòng/giống lúa kháng rầy nâu.. 78 3.1.1. Nghiên cứu đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ cho các tổ hợp lai ............. 78 3.1.2. Đánh giá phản ứng của một số dòng/giống, năm 2008. ...................... 79 3.1.3. Đánh giá phản ứng của các dòng/giống Long An và Hà Nội, 2011. ... 80 3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu ......... 86 3.2.1. Kết quả thiết lập các tổ hợp lai trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu ......... 87 3.2.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN tổng số ....................................... 88 3.2.3. Kiểm tra kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1% .......................... 89 3.2.4. Xác định các chỉ thị phân tử trợ giúp trong chọn giống lúa kháng rầy90 3.2.4.1. Xác định chỉ thị trợ giúp cho đa hình giữa cây bố mẹ đối với gen Bph3 .. 90 3.2.4.2. Xác định chỉ thị phân tử trợ giúp đối với gen BphZ(t)……………..91 3.2.5. Phân tích xác định sự có mặt của gen kháng rầy nâu trong các con lai…...95 3.2.5.1. Phân tích xác định của gen kháng rầy nâu Bph3 trong các dòng BC…….96 3.2.5.2. Phân tích xác định của gen kháng rầy nâu BphZ(t) trong các dòng BC...100 3.2.5.3. Phân tích xác định cá thể mang gen Bph3 trong quần thể chọn tạo giống..103 3.2.5.4. Phân tích xác định cá thể mang gen BphZ(t) trong quần thể CTG………105 3.3. Khảo sát một số dòng triển vọng ngoài đồng ruộng………………………107 3.3.1. Đặc điểm sinh trưởng và năng suất của các dòng triển vọng ............ 107 3.3.2. Kết quả khảo sát đặc tính nông sinh học của 3 dòng ưu tú ................. 113 3.3.2.1. Kết quả khảo sát đặc tính kháng rầy nâu của dòng ưu tú trong nhà lưới .. 113 3.3.2.2. Kết quả đánh giá một số đặc tính nông sinh học ............................. 116 3.4. Kết quả khảo nghiệm VCU dòng DTR64 và dòng KR8 ....................... 130 3.4.1. Kết quả khảo nghiệm quốc gia VCU dòng lúa DTR64, vụ xuân năm 2011 . 130 3.4.2. Khảo nghiệm quốc gia VCU dòng lúa KR8, vụ xuân năm 2012 ....... 132 KẾT LUẬN ................................................................................................... 135 ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 135 vi NHỮNG CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ . 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 137 PHỤ LỤC PHỤ LỤC BẢNG (Bảng xử lý số liệu IRRI START) PHỤ LỤC ẢNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa của chữ viết tắt ANP Anaerobic protein ADN Deoxyribonucleic Axit ARN Ribonucleic Axit Bp Cặp bazơ nitơ Bph Brown plant hopper Gen kháng rầy nâu BVTV Bảo vệ thực vật Ctv Cộng tác viên CTPT Chỉ thị phân tử Chr Nhiễm sắc thể CS Cộng sự CTAB Cetyltrimethyl amonium bromide CTPT Chỉ thị phân tử CV% Hệ số biến động DTNN Di truyền nông nghiệp Đ/C Đối chứng ĐBSH Đồng bằng sông Hồng ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid IRRI Viện nghiên cứu lúa Quốc tế Kb Kilo base KD18 Khang dân 18 KL Khối lượng KL1000 hạt Khối lượng nghìn hạt KHNN Khoa học nông nghiệp viii LSD Sự sai khác có ý nghĩa MABC Marker Assisted Backrossing (Lai lại nhờ chỉ thị phân tử) MAS Marker Assisted selection (Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử) NS Năng suất NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chian Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) QTLs Quantitative Trait Loci (Locut kiểm soát tính trạng số lượng) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn phân cắt) RGA Resistance Gene Analog ( Vùng tương đồng gen kháng) RPG Recurrent parent genotip (Kiểu gen bố mẹ phục hồi) SSR Simple Sequence Repeats (Lặp lại của trình tự đơn giản) TB Trung bình TBE Tris-Boric acid-EDTA TGST Thời gian sinh trưởng TE Tris-EDTA ix DANH MỤC CÁC BẢNG TT BẢNG TÊN BẢNG TRANG 1.1. Các gen kháng rầy nâu và giống chỉ thị mang gen kháng…………....…17 1.2. Mối liên hệ giữa biotype rầy nâu và gen kháng rầy ở lúa ........................ 17 1.3. Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú nhận gen kháng được chuyển vào con lai BCnF1 ................................... 46 2.1. Danh sách các chỉ thị sử dụng trong chọn giống ..................................... 60 2.2. Trình tự các mồi liên kết với gen kháng Bph3 và BphZ(t) ...................... 60 2.3. Thang điểm đánh giá rầy nâu theo IRRI .................................................. 62 2.4. Thang điểm đánh giá rầy nâu theo viện BVTV ....................................... 63 2.5. Thành phần dung dịch EB (Extraction buffer) ....................................... 66 2.6. Thành phần dung dịch CTAB Buffer và dung dịch TE (10 : 0,1) ........... 66 2.7. Dung dịch (10 x TBE) .............................................................................. 68 2.8. Thành phần của mỗi phản ứng PCR ........................................................ 69 2.9. Chương trình chạy phản ứng PCR ........................................................... 70 2.10. Dung dịch gốc 40% acrylamide ............................................................. 71 2.11. Dung dich acrylamide 4.5% ................................................................... 71 2.12. Phương pháp bón phân đạm và kali ..................................................... 74 3.1. Phản ứng của một số dòng giống vật liệu nghiên cứu với quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long ................... 79 3.2. Kết quả đánh giá phản ứng của các dòng/giống trong nhà lưới với quần thể rầy nâu Long an và Hà nội năm 2011 ............................................. 80 3.3 Một số đặc điểm sinh trưởng của các dòng triển vọng ........................... 108 3.4. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng triển vọng vụ mùa 2010 (mật độ 50 khóm/m2) ............................................................................. 109 3.5. Kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm rầy nâu năm 2011 ........................ 114 3.6. Kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm rầy nâu năm 2012 ......................... 115 x 3.7. Một số đặc điểm sinh trưởng của các dòng/giống lúa, vụ xuân năm 2011, 2012, ............................................................................................ 118 3.8. Mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng/giống lúa, vụ xuân năm 2011, 2012 ....................................................................................................... 119 3.9. Độ thuần đồng ruộng và các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng/giống vụ xuân năm 2011, 2012 tại Hà Nội ................................. 120 3.10. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống, vụ xuân năm 2011, 2012 ............................................................................ 120 3.11. Một số đặc điểm sinh trưởng của các dòng/giống lúa vụ mùa năm 2011, 2012 tại Hà Nội (mật độ 50 khóm/m2)…..………………………….122 3.12. Mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng/giống lúa, vụ mùa năm 2011, 2012 tại Hà Nội (mật độ 50 khóm/m2)…………………........................….123 3.13. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống vụ mùa năm 2011, 2012 ............................................................................. 126 3.14. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống vụ mùa năm 2011, 2012 ............................................................................. 126 3.15. Đặc điểm sinh trưởng của dòng DTR64, vụ xuân năm 2011 .............. 131 3.16. Độ thuần đồng ruộng và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng DTR64, vụ xuân năm 2011 ................................................................... 131 3.17. Mức độ nhiễm sâu bệnh của dòng DTR64, vụ xuân năm 2011 ........... 131 3.18. Năng suất thực thu của dòng DTR64, vụ xuân năm 2011 ................. 1310 3.19. Đặc điểm sinh trưởng của dòng KR8, vụ xuân năm 2012 ................... 132 3.20. Độ thuần đồng ruộng và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng KR8, trong khảo nghiêm VCU vụ xuân năm 2012 ........................................ 133 3.21. Mức độ nhiễm sâu bệnh của dòng KR8 trong khảo nghiêm VCU vụ xuân năm 2012 (đvt : điểm) .................................................................. 133 3.22. Năng suất thực thu của dòng KR8 trong khảo nghiệm VCU .............. 134 xi DANH MỤC CÁC HÌNH TT HÌNH TÊN HÌNH TRANG 1.1. Các giai đoạn sinh trưởng của rầy nâu: (a) trứng, (b) ấu trùng, (c) rầy cánh dài, (d) rầy cánh ngắn ........................................................... 6 1.2. Vòng đời rầy nâu ........................................................................................ 9 1.3 Sự phân bố kiểu gen của dòng tái tục ở quần thể BC1F1. ........................ 47 1.4. Sơ đồ Quy trình ........................................................................................ 49 2.1. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu Bph3 ..................................... 57 2.2. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu BphZ(t) ................................. 58 2.3. Cấu tạo hoa lúa ........................................................................................ 64 3.1 Ảnh thí nghiệm đánh giá phản ứng kháng rầy của một số dòng lúa được chọn lọc của Viện Di truyền trong nhà lưới, năm 2007.......................... 78 3.2. Sơ đồ chọn tạo giống lúa KR8 bằng chỉ thị phân tử ................................ 88 3.3. Ảnh thí nghiệm kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN ........................... 89 3.4. Kiểm tra kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.............................90 3.5. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM588 liên kết gen Bph3)…………………………………………………91 3.6. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM190 liên kết gen Bph3)……………………………………………… ...91 3.7. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM5757 liên kết gen BphZ(t))………………………………………………92 3.8. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM 3367 liên kết gen BphZ(t))………………………………………………..…92 3.9. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM 3288 liên kết gen BphZ(t))…………………………………………..……93 3.10. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM6997 liên kết gen BphZ(t))……………………………………………..93 xii 3.11. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM 3735 liên kết gen BphZ(t))……………………………………………...93 3.12. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM5714 liên kết gen BphZ(t))……………………………………………..94 3.13. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ(Chỉ thị RM5757 liên kết gen BphZ(t))...............................................................94 3.14. Ảnh kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR (RM588) liên kết gen Bph3 xác định con lai BC1F1 mang gen kháng ................................................ 97 3.15. Sử dụng chỉ thị phân tử RM588 liên kết với gen Bph3 để xác định cá thể mang gen kháng ở thế hệ F2...................................................................98 3.16. Kết quả sử dụng chỉ thị RM190 liên kết Bph3 trong chọn lọc các cá thể mang gen kháng của dòng BC ................................................................ 99 3.17. Kết quả xác định cá thể BC3F3 mang chỉ thị RM588 liên kết gen Bph3 của tổ hợp IR64/IS1.2 ............................................................................ .99 3.18. Ảnh sử dụng chỉ thị phân tử SSR (RM5757) liên kết với gen BphZ(t) xác định con lai BC1F1 mang gen kháng .............................................. 101 3.19. Kết quả sử dụng chỉ thị RM3367 liên kết BphZ(t) trong chọn lọc các cá thể mang gen kháng của dòng BC........................................................102 3.20. Kết quả sử dụng chỉ thị RM3735 liên kết BphZ(t) trong chọn lọc các cá thể mang gen kháng của dòng BC .................................................... 102 3.21. Kết quả sử dụng chỉ thị RM190 liên kết Bph3 trong chọn lọc các cá thể mang gen kháng của dòng 64R8-1 (KR8) của tổ hợp IR64/IS1.2 ..………103 3.22. Kết quả sử dụng chỉ thị RM588 liên kết gen Bph3 của tổ hợp IR64/IS, trong chọn lọc các cá thể dòng 64R8-2 (KR8a) mang gen kháng. ...... 104 3.23. Kết quả sử dụng chỉ thị RM190 liên kết gen Bph3, trong chọn lọ