Luận án Nghiên cứu chọn tạo và biện pháp nâng cao năng suất, phẩm chất dòng dưa hấu (citrullus vulgaris l.) tam bội in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRẦN THANH TRUYỀN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO VÀ BIỆN PHÁP NÂNG CAO NĂNG SUẤT, PHẨM CHẤT DÒNG DƢA HẤU (Citrullus vulgaris L.) TAM BỘI IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRẦN THANH TRUYỀN NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO VÀ BIỆN PHÁP NÂNG CAO NĂNG SUẤT, PHẨM CHẤT DÒNG DƢA HẤU (Citrullus vulgaris L.) TAM BỘI IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs. Ts. LÂM NGỌC PHƢƠNG 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án “Nghiên cứu chọn tạo và biện pháp nâng cao năng suất, phẩm chất dòng dƣa hấu (Citrullus vulgaris L.) tam bội in vitro” được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày . tháng.năm 2019 Người hướng dẫn Tác giả PGS.TS. Lâm Ngọc Phƣơng Trần Thanh Truyền LỜI CẢM TẠ Xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lâm Ngọc Phương, người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng, tạo mọi điều kiện cả về vật chất lẫn tình thần cũng như luôn góp ý, với những lời khuyên chân thành, bổ ích và sáng tạo trong việc hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Cần thơ, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Ban quản lý Khoa Sau đại học và Bộ môn Khoa học cây trồng, Đại học Cần Thơ tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành các chương trình học cũng như thủ tục hoàn thành luận án. Quý Thầy, Cô và các anh chị thuộc Bộ Môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã luôn đồng hành và tạo điều kiện cho tôi để hoàn thành luận án. Các sinh viên, học viên cao học và các nông dân ở Cần Thơ, Hậu Giang đã giúp đỡ tôi trong các thí nghiệm ngoài đồng của luận án. Trần Thanh Truyền TÓM TẮT “Nghiên cứu chọn tạo và biện pháp nâng cao năng suất, phẩm chất dòng dưa hấu (Citrullus vulgaris L.) tam bội in vitro” được thực hiện tại Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ và hai tỉnh Hậu Giang, Cần Thơ. Mục tiêu nghiên cứu là chọn tạo được dòng dưa hấu tam bội in vitro có xuất xứ Việt Nam; đề xuất qui trình sản xuất cây dưa hấu tam bội cấy mô làm cơ sở để chọn tạo thêm các dòng tam bội khác và khắc phục nhược điểm của hạt giống tam bội có sức nảy mầm kém, khó lưu trữ. Nghiên cứu gồm 4 giai đoạn chính: (1) Tạo cây dưa hấu tứ bội in vitro bằng hóa chất colchicine và oryzalin; (2) Nhân dòng vô tính cây dưa hấu tứ bội in vitro và lai tạo hạt lai dưa hấu tam bội; (3) Nhân dòng vô tính cây dưa hấu tam bội in vitro và khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của các dòng dưa hấu tam bội cấy mô ngoài đồng; (4) Đánh giá ảnh hưởng của lượng phân đạm và mật độ đến khả năng sinh trưởng, phát triển và phẩm chất trái của dòng dưa hấu tam bội cấy mô ngoài đồng. Giai đoạn (1): bằng cách xử lý đỉnh sinh trưởng dưa hấu nhị bội in vitro với hóa chất đa bội hóa colchicine 0,01% và oryzalin 0,004% đều tạo chồi tứ bội. Xử lý colchicine trong 8 ngày đạt 9% và xử lý oryzalin trong 54 giờ đạt 4% cây tứ bội, kiểm tra bằng phân tích dòng chảy tế bào. Đối với giai đoạn (2) các cây tứ bội in vitro được chọn lọc từ giai đoạn (1) làm vật liệu nhân chồi cấy mô. Kết quả cho thấy việc bổ sung BA 1 mg/L cho hiệu quả nhân chồi (2,6 chồi) và bổ sung IBA 1 mg/L cho hiệu quả tạo rễ (9-12 rễ) hình thành cây hoàn chỉnh. Các dòng cây dưa hấu tứ bội cấy mô được trồng tại Hậu Giang, kết quả cho thấy các dòng cây dưa hấu tứ bội sinh trưởng, phát triển tốt ngoài đồng, được sử dụng làm cây mẹ để lai tạo thành công hạt lai dưa hấu tam bội. Đối với giai đoạn (3): kết quả cho thấy môi trường chỉ bổ sung nồng độ BA 1,0 mg/L cho hiệu quả tái sinh chồi các dòng dưa hấu tam bội cao nhất sau 3 tuần nuôi cấy với chồi khỏe, không bị thủy tinh thể. Số rễ, chiều dài rễ cũng như số lá và chiều cao cây dưa hấu tam bội tốt nhất được ghi nhận ở môi trường bổ sung IBA 0,5 mg/L và than hoạt tính 2,0 g/L. Ở điều kiện đồng ruộng tại Cần Thơ, hai dòng dưa hấu tam bội (TriP1 và TriP2) cấy mô sinh trưởng và phát triển tốt. Dòng TriP1 có chiều dài dây, số lá/dây, kích thước lá cao hơn giống đối chứng và dòng TriP2. Tuy nhiên khối lượng trái, năng suất và phẩm chất trái (độ Brix và độ dày vỏ) không khác biệt. Dòng TriP1 trồng ở Hậu Giang, cho sự sinh trưởng tương đương giống đối chứng và dòng TriP2. Đồng thời khối lượng trái và năng suất (lần lượt là 2,2 kg-36,91 tấn/ha) của dòng TriP1 cao hơn giống đối chứng (1,73 kg-28,94 tấn/ha) và dòng TriP2 (1,55 kg-25,56 tấn/ha), nhưng phẩm chất trái tương đương. Đối với giai đoạn (4): nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dưa hấu tam bội được trồng ở mật độ 10.000 cây/ha cùng lượng phân đạm cao (200 kg N/ha) đạt hiệu quả với năng suất trái cao (23,19 tấn/ha), độ Brix trái >10% so với mật độ 8.750 cây/ha cùng lượng phân đạm thấp (150kg/ha). Từ khóa: colchicine, oryzalin, đa bội in vitro, dưa hấu tứ bội, dưa hấu tam bội, nuôi cấy mô. ABSTRACT "Investigate on breeding and measuring to improve yield and quality of triploid watermelons (Citrullus vulgaris L.) in vitro" was conducted at Faculty of Agriculture and Applied Biology of Can Tho University and two provinces of Hau Giang, Can Tho. The objective of the study is to make a triploid watermelon in vitro originated from Vietnam; to propose a method of production of triploid watermelon seedlings as a basis for selecting more triploid lines and overcoming the disadvantages of triploid seedlings with poor germination, difficult storage. The study consists of four main phases: (1) Producing tetraploid watermelon in vitro with colchicine and oryzalin; (2) Cloning the tetraploid watermelon in vitro and hybridise the watermelon triploid triploid; (3) Cloning watermelon triploid in vitro and investigated the growth and development of watermelon triploid watermelon lines; (4) Evaluate the effect of N fertilizer and density on the growth, development and fruit quality of the transgenic watermelon. Phase (1): By treating the diploid watermelon growth peak in vitro with 0.01% colchicine multi-particulate and 0.004% oryzalin, all tetraploid shoots were formed. Treatment of colchicine in 8 days reached 9% and treatment with oryzalin in 54 hours reached 4% tetraploid, and it was tested by cell flow analysis. For phase (2), tetraploid plants in vitro were selected from stage (1) as tissue culture multiplication. The results showed that supplementation with BA 1 mg/L for shoot propagation (2.6 shoots) and IBA 1 mg/L supplementation gave the rooting effect (9-12 roots) of complete tree formation. The tetraploid watermelon seedlings were planted in Hau Giang, the results showed that the lines of watermelon tetraploid grows well in the field, they were used as a mother to breed watermelon hybrid triploid seeds. For phase (3): the results showed that the medium supplemented with BA 1.0 mg/L gave the highest regeneration efficiency of the watermelon triploid shoots after 3 weeks of culture with healthy shoots, limiting the cataracts. The number of roots, root length as well as number of leaves and height of triploid watermelon were best recorded in medium supplemented with IBA 0.5 mg/L and activated charcoal 2.0 g/L. At field conditions in Can Tho, two lines of triploid watermelon (TriP1 and TriP2) were implanted tissue growth and they developed well. The TriP1 line has the liana length, number of leaf/a liana, leaf size higher than the control variety and the TriP2 line. However, fruit mass, fruit quality and fruit productivity (Brix and shell thickness) were not significantly different. The TriP1 line, which grows in Hau Giang, has the same growth as the one in the control variety‟s and the TriP2 line. At the same time, fruit weight and productivity (2.2 kg - 36.91 tons/ha, respectively) of the TriP1 line were higher than the control varieties (1.73 kg-28.94 tons/ha) and TriP2 (55 kg-25.56 tons/ha), but the fruit quality is equivalent. For phase (4), research has shown that triploid watermelon is planted at a density of 10.000 trees per hectare and a high amount of nitrogen fertilizer (200 kg N/ha) giving high fruit productivity (23.19 tons/ha), fruit‟s Brix >10% compared to 8.750 plants/ha and low nitrogen fertilizer (150 kg/ha). Từ khóa: colchicine, oryzalin, polyploidy in vitro, tetraploid watermelon, triploid seedless watermelon, micropropagation. i MỤC LỤC Trang DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... viii DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xiv CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU ............................................................................. 1 1.1 Mục tiêu của luận án .................................................................................... 1 1.2 Ý nghĩa của luận án:..................................................................................... 2 1.3 Điểm mới của luận án: ................................................................................. 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 2.1 Giới thiệu chung về cây dưa hấu.................................................................. 3 2.1.1 Nguồn gốc ........................................................................................ 3 2.1.2 Giá trị dinh dưỡng và công dụng của dưa hấu ................................. 3 2.2 Vai trò của giống dưa hấu trong trồng trọt ................................................... 4 2.3 Đa bội thể cùng nguồn trong công tác chọn tạo giống ................................ 4 2.3.1 Khái niệm ......................................................................................... 4 2.3.2 Đặc điểm và vai trò của đa bội thể cùng nguồn trong công tác chọn tạo giống .................................................................................................... 4 2.4 Tác nhân hóa học gây ra đa bội thể ............................................................. 5 2.4.1 Cơ sở khoa học tạo thể đa bội bằng colchicine và oryzalin ............. 6 2.4.2 Kỹ thuật xử lý đa bội bằng tác nhân hóa học ................................... 7 2.4.3 Một số nghiên cứu tạo dưa hấu đa bội bằng hóa chất trên đỉnh sinh trưởng ........................................................................................................ 8 2.5 Phương pháp xác định cây đa bội ................................................................ 9 2.5.1 Hình thái và đặc điểm sinh trưởng, phát triển .................................. 9 2.5.2 Mật số khí khẩu/đơn vị diện tích lá và chiều dài khí khẩu ............ 10 2.5.3 Đếm số lượng nhiễm sắc thể ........................................................... 11 2.5.4 Phân tích flow cytometry (dòng chảy tế bào) bằng máy đo đa bội thể (Partec Ploidy Analyser) .................................................................... 11 2.6 Dưa hấu tam bội (không hạt) ..................................................................... 14 ii 2.6.1 Kỹ thuật lai tạo dòng dưa hấu tam bội ........................................... 15 2.6.2 Một số nghiên cứu chọn tạo giống dưa hấu không hạt .................. 17 2.7 Vai trò của vi nhân giống đối với cây trồng ............................................... 19 2.7.1 Khái niệm ....................................................................................... 19 2.7.2 Vai trò ............................................................................................. 19 2.7.3 Một số nghiên cứu vi nhân giống dưa hấu đa bội trong nước ....... 20 2.8 Ảnh hưởng của mật độ trồng và lượng phân đạm đến năng suất, phẩm chất trái dưa hấu .............................................................................................. 21 2.8.1 Mật độ trồng ................................................................................... 21 2.8.2 Lượng phân đạm ............................................................................ 21 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................... 23 3.1 Cảm ứng tạo thành cây dưa hấu tứ bội in vitro bằng colchicine và oryzalin trên các dòng dưa hấu nhị bội ................................................................. 23 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian xử lý colchicine lên sự sinh trưởng của hai dòng dưa hấu nhị bội TPS và TPT in vitro ..................... 23 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin lên sự sinh trưởng của bốn dòng dưa hấu nhị bội in vitro ......................................... 26 3.2 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng của hai dòng tứ bội TPT và TPS trong môi trường có bổ sung BA .................................. 27 3.2.1 Vật liệu ........................................................................................... 27 3.2.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 27 3.2.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 27 3.3 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng của hai dòng tứ bội TPB và TPX trong môi trường có bổ sung BA................................. 28 3.3.1 Vật liệu ........................................................................................... 28 3.3.2 Môi trường nuôi cấy: tương tự thí nghiệm 3 ................................. 28 3.3.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 28 3.4 Thí nghiệm 5: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của dòng tứ bội TPT trên môi trường có bổ sung IBA và NAA ............................................... 28 3.4.1 Vật liệu ........................................................................................... 28 3.4.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 28 iii 3.4.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 28 3.5 Thí nghiệm 6: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của dòng tứ bội TPS trên môi trường có bổ sung IBA và NAA ............................................... 29 3.5.1 Vật liệu ........................................................................................... 29 3.5.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 29 3.5.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 29 3.6 Thí nghiệm 7: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của bốn dòng tứ bội trên môi trường có bổ sung IBA ............................................................. 29 3.6.1 Vật liệu ........................................................................................... 29 3.6.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 29 3.6.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 29 3.7 Thí nghiệm 8: Đánh giá, chọn lọc các dòng tứ bội cấy mô và lai tạo hạt tam bội ngoài đồng .................................................................................. 30 3.7.1 Vật liệu ........................................................................................... 30 3.7.2 Phương pháp thuần dưỡng ............................................................. 30 3.7.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 30 3.8 Thí nghiệm 9: Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng của các dòng tam bội cấy mô trên môi trường có bổ sung BA ..................................... 32 3.8.1 Vật liệu ........................................................................................... 32 3.8.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 32 3.8.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 32 3.9 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng tạo chồi, sinh trưởng của dòng dưa hấu tam bội TriP1 trên môi trường có bổ sung BA và than hoạt tính ............ 33 3.9.1 Vật liệu ........................................................................................... 33 3.9.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 33 3.9.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................ 33 3.10 Thí nghiệm 11: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của ba dòng dưa hấu tam bội cấy mô trên môi trường có bổ sung IBA ............................. 33 3.10.1 Vật liệu ......................................................................................... 33 3.10.2 Môi trường nuôi cấy ..................................................................... 33 3.10.3 Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 33 iv 3.11 Thí nghiệm 12: Đánh giá khả năng tạo rễ, sinh trưởng của dưa hấu tam bội TriP1 trên môi trường có bổ sung IBA và than hoạt tính.................. 33 3.11.1 Vật liệu ......................................................................................... 33 3.11.2 Môi trường nuôi cấy ..................................................................... 34 3.11.3 Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 34 3.12 Thí nghiệm 13: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, năng suất và phẩm chất trái của hai dòng dưa hấu tam bội (3x) cấy mô ngoài đồng .. 34 3.12.1 Vật liệu ......................................................................................... 34 3.12.2 Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 34 3.13 Thí nghiệm 14: Khảo sát sự ảnh hưởng của liều lượng phân đạm (N) và mật độ trồng lên năng suất, phẩm chất của dòng dưa hấu tam bội TriP1 cấy mô ..................................................................................................... 35 3.13.1 Vật liệu ......................................................................................... 35 3.13.2 Chuẩn bị đất thí nghiệm ............................................................... 35 3.13.3 Thời gian và địa điểm thí nghiệm ................................................ 35 3.13.4 Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 35 3.14 Phương pháp phân tích số liệu ................................................................. 37 3.15 Sơ đồ tóm tắt các thí nghiệm ................................................................... 38 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...................................................... 39 4.1 Cảm ứng tạo thành cây dưa hấu tứ bội in vitro bằng colchicine và oryzalin trên các dòng dưa hấu nhị bội ................................................................. 39 4.1.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý colchicine lên sự sinh trưởng của 2 dòng dưa hấu nhị bội TPS và TPT in vitro.............................................. 39 4.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý oryzalin lên sự sinh trưởng của 4 dòng dưa hấu nhị bội in vitro .................................................................. 42 4.1.3 Cảm ứng tạo thành cây tứ bội in vitro bằng colchicine và oryzalin 45 4.2 Đánh giá khả năng tạo chồi và sinh trưởng hai dòng tứ bội TPT và TPS trong môi trường có bổ sung BA .......................................................