Luận án Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (glycine max (L.) merr.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------- NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) Merr.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------- NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) Merr.) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Khuất Hữu Trung 2. GS.TS. Ngô Xuân Bình Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào hoặc chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào. Tôi xin cam đoan r ng, mọi sự gi p đ , hợp tác cho việc thực hiện luận án này đ được cảm n và các thông tin tr ch d n trong luận án này đ u được ch d n r ngu n gốc. Nghiên cứu sinh Nguyễn Trịnh Hoàng Anh ii LỜI CẢM ƠN ể hoàn thành luận án này, tôi đ nhận được sự quan tâm, gi p đ nhiệt tình của các Th y, ô giáo, các tập thể, cá nhân, gia đình c ng b n b đ ng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc đến PGS.TS. Khuất Hữu Trung, GS.TS Ngô Xuân Bình - là th y giáo hướng d n khoa học, đ tận tình gi p đ , truy n tải kiến thức và kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đ tài và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm n Ban l nh đ o Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; tập thể cán bộ Ban Thông tin và ào t o; tập thể L nh đ o và cán bộ viên chức Trung Tâm chuyển giao công nghệ và khuyến nông đ giúp đ , hỗ trợ tận tình cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đ tài. Tôi xin chân thành cảm n Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm, Trường i học Nông Lâm, i học Thái Nguyên là n i tôi triển khai thực hiện đ tài, đ t o mọi đi u kiện thuận lợi v tài liệu khoa học, c sở vật chất, thiết bị phục vụ nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án. ặc biệt, tôi xin bày tỏ sự biết n đến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm đ chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm chuyên môn để tôi hoàn thành nghiên cứu trong thời gian sớm nhất. uối cùng, tôi xin chân thành cảm n b n b , đ ng nghiệp trong và ngoài c quan và người thân trong gia đình luôn hết lòng động viên, kh ch lệ và gi p đ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm n! H N i, ng y th ng năm 2023 Nghiên cứu sinh Nguyễn Trịnh Hoàng Anh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ix DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... xi DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... xiv MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 3 2.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 3 2.2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ............................................... 3 3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................... 4 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .............................................................. 4 4.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 4 4.2. Phạm vi, thời gian nghiên cứu ................................................................. 4 5. Những đóng góp mới của luận án .............................................................. 4 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................................................. 6 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và Việt Nam .................... 6 1.1.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới ......................................... 6 1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ........................................... 8 1.2. Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tƣơng trên thế giới . 9 1.2.1. Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương .................................. 9 iv 1.2.1.1. Vật liệu sử dụng trong t i sinh in vitro ở cây đậu tương ..................... 9 1.2.1.2. Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương ............... 10 1.2.1.3. Ph t sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong t i sinh in vitro cây đậu tương ....................................................................................................... 12 1.2.1.4. Ph t sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hình th nh mô sẹo) .................................................................................................. 13 1.2.1.5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy v điều kiện nuôi cấy đến khả năng t i sinh đậu tương .................................................................................. 14 1.2.2. Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới ............... 15 1.2.2.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ............................... 15 1.2.2.2. Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen ....................................... 18 1.2.2.3. Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện ............................................ 19 1.2.2.4. Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn ............................................... 19 1.2.3. Các tính trạng được cải thiện thông qua chuyển gen ở cây đậu tương 20 1.2.3.1. Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ ............................................................. 21 1.2.3.2. Đặc tính kh ng côn trùng ................................................................... 21 1.2.3.3. Chuyển gen nâng cao h m lượng dầu ............................................... 25 1.2.3.4. Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh ............ 25 1.2.3.5. Chuyển gen nâng cao năng suất ........................................................ 26 1.2.3.6. Chuyển gen tạo cây trồng đa tính trạng ............................................ 26 1.2.4. Thành tựu về cây trồng chuyển gen trên thế giới .............................. 27 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nƣớc ...................................... 31 1.3.1. Chọn tạo giống thông qua tuyển chọn vật liệu nhập nội và địa phương 31 1.3.2. Chọn tạo giống đậu tương mới bằng lai hữu tính ............................. 32 v 1.3.3. Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lý đột biến...................... 32 1.3.4. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương ở Việt Nam ........................... 33 1.3.4.1. Nghiên cứu t i sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương ... 33 1.3.4.2. Nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương ................................................. 34 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tƣơng .............................................................. 35 1.4.1. Nghiên cứu về vai trò của gen kìm hãm già hóa bộ lá ....................... 35 1.4.2. Nghiên cứu gen điều khiển quá trình tăng cường kích thước hạt ở cây đậu tương ................................................................................................. 38 1.5. Một số nhận xét rút ra từ tổng quan tài liệu ....................................... 40 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 41 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 41 2.1.1. Vật liệu thực vật ................................................................................... 41 2.1.2. Vật di truyền ......................................................................................... 42 2.1.3. Hóa chất, thiết bị sử dụng .................................................................... 42 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 43 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 44 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 44 2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen ........................................................ 44 2.4.1.1. Nghiên cứu khả năng t i sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của c c giống đậu tương .............................................................................................. 44 2.4.1.2. Đ nh gi khả năng tiếp nhận gen của c c giống đậu tương ............. 48 vi 2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis ............... 50 2.4.2.1. Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóa lá Atore1 ..................... 50 2.4.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm gi hóa l Atore1 .... 51 2.4.2.3. Đ nh gi khả năng biểu hiện của gen kìm hãm gi hóa l Atore1 trên cây mô hình Arabidopsis thaliana .................................................................. 52 2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen kìm hãm già hóa lá Ore1 vào cây đậu tương và đánh giá các dòng chuyển gen .................................................................. 55 2.4.3.1. Nghiên cứu chuyển gen Atore1 v o cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ............................................................................ 55 2.4.3.2. Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen ....................................................................................................... 57 2.4.3.3. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 v đ nh gi biểu hiện gen ............................................................................................ 58 2.4.3.4. Đ nh gi khả năng sinh trưởng, ph t triển của c c dòng đậu tương chuyển gen ....................................................................................................... 59 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................... 60 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................. 61 3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tƣơng để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen .................................................................. 61 3.1.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của các giống đậu tương ................................................................................ 61 3.1.1.1. Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ........................................................ 61 3.1.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng t i sinh chồi từ nốt l mầm ........ 62 vii 3.1.1.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng t i sinh chồi từ nốt lá mầm .... 68 3.1.1.4. Kết quả ảnh hưởng của h m lượng GA3 đến khả năng kéo d i chồi của m t số giống đậu tương ............................................................................ 76 3.1.1.5. T i sinh rễ tạo cây ho n chỉnh ........................................................... 77 3.1.2. Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương ............. 79 3.2. Kết quả tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis .................... 86 3.2.1. Tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 ............................................. 86 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Atore1 ... 90 3.2.2.1. Gắn gen Atore1 vào vector chuyển gen ............................................. 90 3.2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn E.coli v Agrobacterium tumefaciens mang gen Atore1 .............................................................................................................. 92 3.2.3. Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên cây mô hình Arabidopsis thaliana ................................................................. 92 3.2.3.1. Chuyển gen Atore1 v o cây mô hình Arabidopsis ............................. 92 3.2.3.2. Chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen T1 mang gen Atore1 .............. 93 3.2.3.3. Đ nh gi cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T1 94 3.2.3.4. Đ nh gi biểu hiện gen thông qua hình th i của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1 ............................................................................ 95 3.2.3.5. Đ nh gi cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T2 . 96 3.2.3.6. Đ nh gi biểu hiện gen thông qua hình th i l ở cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T2 ............................................................................ 97 3.3. Kết quả chuyển gen kìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đậu tƣơng và đánh giá các dòng chuyển gen .................................................................... 100 viii 3.3.1. Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ............................................................. 100 3.3.1.1. Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biến nạp gen ........... 100 3.3.1.2. Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạp gen Atore1 .................................. 101 3.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng đ vi khuẩn đến khả năng biến nạp ............... 102 3.3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen . 105 3.3.1.5. Ảnh hưởng của nồng đ Acetosyringon (AS) đến khả năng biến nạp gen ................................................................................................................. 106 3.3.1.6. Ảnh hưởng của kh ng sinh chọn lọc đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen ở cây đậu tương.......................................................................... 108 3.3.1.7. T i sinh v chọn lọc chồi chuyển gen Atore1 trên môi trường kháng sinh ..................................................................................................... 110 3.3.1.8. Tạo cây đậu tương chuyển gen Atore1 ho n chỉnh ......................... 111 3.3.1.9. Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen trồng trong vườn thí nghiệm 112 3.3.2. Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen .................................................................................................... 113 3.3.2.1. Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0...................................................................................... 113 3.3.2.2. Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen thế hệ thế hệ T1 ........................................................................... 116 3.3.2.3. Chọn lọc cây đậu tương chuyển gen kìm hãm gi hóa l Atore1 ở thế hệ T2 ............................................................................................................... 121 3.3.3. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 và đánh giá biểu hiện gen ......................................................................................... 126 3.3.3.1. Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 ............. 126 ix 3.3.3.2. Đ nh gi biểu hiện gen của dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tử thông qua hình thái ............................................................................ 129 3.3.3.3. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển ở c c dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử bằng Southern blot .................................... 131 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen đồng hợp tử T3 ........................................................................... 133 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 144 1. Kết luận .................................................................................................... 144 2. Đề nghị ...................................................................................................... 145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................................................................................................. 146 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 147 PHỤ LỤC ..................................................................................................... 163 ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải AtBBX32 The Arabidopsis thaliana BBX32 Atore1 Arabidopsis thaliana Ore1 Bp ặp baz Base pairs Bt Bacillus thuringiensis CBF C-repeat/dehydration responsive element bingding factor CBF1 C-repeat/DRE binding factor 1 CCM Co-Culture Medium CNSH ông nghệ sinh học cs ộng sự DNA Deoxyribonucleic acid x t Deoxyribonucleic /c ối chứng ELISA Enzym-linked Immuno Sorbent Assay FAOSTAT Tổ chức Lư ng thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (Food and Agriculture Organization) GMO Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism) GM Germination Medium GUS Beta-Glucuronidase reporter gene ISAAA Tổ chức Dịch vụ quốc tế v ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications) LSD Least Significant Difference Test Maker h thị mRNA Messenger Ribonucleic acid NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn ORE1 ORESARA1 PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) x RM Root Medium RNA Ribonucleic acid SEM Shoot Elongation Medium SAAT Sonicate Assisted Agrobacterium - media Transformation Phư ng pháp biến n p gen ở đậu tư ng SIM Shoot Inducing Medium TB Trung bình xi DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Tình hình sản xuất đậu tư ng trên thế giới những năm g n đây ......................... 6 1.2. Tình hình sản xuất đậu tư ng của một số nước đứng đ u trên thế giới trong những năm g n đây sản lượng trên 1 triệu tấn) .................................................. 7 1.3. Tình hình sản xuất đậu tư ng Việt Nam giai đo n 2012-2021 ............................ 8 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tư ng của Việt 2020-2022) ........................................ 9 1.5. Một số môi trường tái sinh cây đậu tư ng in vitro ............................................ 14 1.6. Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 theo quốc gia ......................... 27 1.7. ác giống ậu tư ng tuyển chọn từ ngu n nhập nội ........................................ 31 2.1. Danh sách các giống đậu tư ng sử dụng trong nghiên cứu ............................... 41 2.2. Trình tự m i