Luận án Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM)BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số : 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa 2. TS. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ HÀ NỘI - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trần Duy Dương ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các thầy cô giáo và Khoa sau đại học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Phó Giáo sư, Tiến sĩ Lã Tuấn Nghĩa và Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Thủy, những người thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Tiến sĩ Khuất Hữu Trung, Tiến sĩ Trần Hoàng Dũng, Kỹ sư Nguyễn Trường Khoa, các bạn bè đồng nghiệp Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm để hoàn thành bản luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình của tôi là nguồn động viên và truyền nhiệt huyết để tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày..tháng..năm 2015 Nghiên cứu sinh Trần Duy Dƣơng iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems Incorporated AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism atpβ gene ATP synthase beta-subunit gene BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair C Cymbidium cpDNA Chloroplast DNA CTAB Cetyltrimethyl ammoium bromide D Dendrobium DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide HT Hoàng Thảo ISSRs Inter-simple sequence repeats EDTA Ethylenediamine tetraacetate ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ML Maximum Likehood matK Maturase K ln likelihood mtDNA Mitochondrial DNA iv NCBI National Center for Biotechnology Information ndhF NADH dehydrogenase subunit F nDNA Nuclear DNA ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction QTLs Quantitative trait locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNA rbcL Ribulose-bisphosphate carboxylase rDNA Ribosomal DNA rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid RNAse Ribounuclease SCARs Sequence - Characterized Amplified Region sect Section SSR Simple Sequence Repeates Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA Tm Melting Temperature U Unit UV Ultraviolet V Voltex ΣDNA DNA tổng số v DANH MỤC BẢNG BIỂU TT bảng Tên bảng Số trang 2.1 Tên và trình tự các mồi RAPD trong nghiên cứu...... 42 2.2 Thành phần và thể tích các chất trong phản ứng PCR 42 2.3 Chu trình của phản ứng PCR.. 43 2.4 Mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng ITS.................................................................................. 44 2.5 Cách thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng ITS.. 44 2.6 Chu kì nhiệt khuếch đại vùng ITS.. 45 3.1 Nam được sử dụng trong nghiên cứu... 50 3.2 . 53 3.3 ... 61 3.4 Đặc điểm hình thái hoa của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo trong nghiên cứu 70 3.5 Thống kê số băng ADN được nhân lên ở các mẫu giố ứuvới 20 mồi RAPD........ 94 3.6 Tổng hợp kết quả phân tích số liệu với 20 mồi RAPD.... 99 3.7 Độ dài trình tự ITS của 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo.................................................................................... 111 3.8 Độ dài trình tự của vùng ITS mẫu giống D1 và hai mẫu giống D. fimbriatum của thế giới...................................... 113 3.9 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D2 và D18 và hai mẫu giống D. findlayanum của thế giới ................. 115 3.10 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D4 và hai mẫu giống D. anosmumcủa thế giới......................................... 116 3.11 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D10 và hai mẫu giống D. hancockiicủa thế giới........................................ 117 vi 3.12 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D7, D8 và hai mẫu giống D. chysanthumcủa thế giới............................. 119 3.13 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D9, D29 và hai mẫu giống D. primulinum của thế giới........................... 120 3.14 Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo được nhận dạng dựa trình tự vùng ITS..... 133 vii DANH MỤC CÁC HÌNH TT hình Tên hình Số trang 2.1 Cấu trúc phân bố vùng mồi ITS1 và ITS4.. 44 3.1 Các mẫu giống Hoa lan Hoàng Thảo được trồng và chăm sóc tại nhà vườn, 422 đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội....................... 52 3.2 Hình dạng thân của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo.. 59 3.3 Hình dạng lá của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo...... 67 3.4 Một số kiểu hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo............ 68 3.5 Hình dạng cánh môi các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo 69 3.6 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo dựa trên chỉ thị hình thái........ 87 3.7 Ảnh điện di ADN tổng số của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo......... 92 3.8 - 7................................................. 95 3.9 - 20................................................... 96 3.10 Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN16.................................................. 97 3.11 Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN11............................... 97 3.12 Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN9.... 98 3.13 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa trên chỉ thị phân tử RAPD....................................................................................... 102 3.14 Các mẫu giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5 (Trầm tím), D6 (Trầm trắng)................................................... 104 3.15 Hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều tím viii (D12), Kiều vàng (D13)và Kiều trắng (D14).................... 105 3.16 Hai mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo D24 (HT Vảy rồng lá nhỏ), D25 (HT Vảy rồng lá trung)................................. 106 3.17 Ảnh điện di đoạn ITS của quả 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4.................................................................................... 110 3.18 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D1 và hai mẫu giống D. fimbriatum |JN388588.1| và |HQ114229.1|........................ 114 3.19 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D2, D18 và hai mẫu giống D. findlayanum |KF143462.1|,|HQ114257.1|.......................... 115 3.20 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D4 với hai mẫu giống D. anosmum |EU477499.1......................................................... 117 3.21 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D10 với hai mẫu giống D. hancockii |AB593575.1| và |HQ114259.1|............................ 118 3.22 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D7, D8 với hai mẫu giống D.chysanthum |JN388584.1|, |FJ384738.1|............................ 120 3.23 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D9, D29 với hai mẫu giống D. primulinum |AB593521.1|,|AB593641.1|............................ 121 3.24 So sánh trình tự của mẫu giống D25 (HT Vảy rồng lá trung) trên ngân hàng gen Blast.......................................................... 123 3.25 Sơ đồ cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng ITS............. 125 ix MỤC LỤC Lời cam đoan ........................................................................................................ ..i Lời cảm ơn ............................................................................................................ .ii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ............................................................... iii Danh mục bảng biểu ............................................................................................. ..v Danh mục các hình ............................................................................................... .vi MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................5 1.1. Sơ lược về chi lan Hoàng Thảo ................................................................ 5 1.1.1. Hệ thống phân loại .............................................................................. 5 1.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 6 1.1.3. Phân bố vùng sinh thái ........................................................................ 9 1.2. Giá trị sử dụng của hoa lan Hoàng Thảo ............................................... 11 1.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật ............................................................. 12 1.3.1. Khái niệm về đa dạng di truyền ........................................................ 12 1.3.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền ............................... 13 1.3.3. Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật .............................................................................. 13 1.4. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam ................... 23 1.4.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan trên thế giới ................................................................... 23 1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam ....................................... 34 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 39 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 39 x 2.2.1. Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam ................................................................... 39 2.2.2. Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân để nhận dạng chính xác một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa trong tập đoàn nghiên cứu. .......................................................................... 39 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 39 2. 3.1. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái ...................... 39 2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền mở mức phân tử bằng chỉ thị RAPD ............................................................................................... 40 2.3.3. Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân .................................. 44 2.4. Phần mềm xử lý số liệu ......................................................................... 47 2. 5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 48 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.................49 ........ 49 3.1.1. Kết quả đánh giá đa dạng si truyền bằng chỉ thị hình thái ............... 52 3.1.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử .......................... 91 3.1.3. Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo ......................................... 107 3.2. Kết quả nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa vào trình tự vùng ITS ........................................................................................... 109 3.2.1. Kết quả khuếch đại vùng ITS bằng PCR ....................................... 109 3.2.2. Kết quả phân tích trình tự các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên trình tự ITS .................................................................................. 110 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 138 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Họ lan, hay họ phong lan, (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc bộ lan (Orchidaceae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotydonea). Đây là một trong những họ lớn nhất của thực vật bao gồm 800 chi khác nhau, chúng được phân bố ở trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực (Trần Hợp, 1989; Huang và Chen, 2010). Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng về hình dáng, màu sắc và kích thước với hơn 1148 loài khác nhau, đứng thứ 2 trong họ hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch và cs., 2009). Vùng Đông Nam Á có thể coi là quê hương của chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài, riêng ở Việt Nam đã có hơn 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân Linh, 2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng được phân bố rộng rãi trên khắp các vùng miền trong cả nước. Với một số lượng lớn các loài của chi lan Hoàng Thảo có giá trị như vậy, cho đến nay vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền tập đoàn hoa lan Hoàng Thảo Việt Nam một cách sâu rộng, bài bản và có hệ thống. Do đó, việc đặt tên cho từng giống vẫn rất lộn xộn từ những tên giống được dịch sang từ tiếng Anh và tiếng Latin, có rất nhiều tên giống trùng nhau. Bên cạnh đó, việc di chuyển các giống lan Hoàng Thảo giữa các vùng, các nước khác nhau đã gây ra sự nhầm lẫn và hiểu sai về xuất xứ, nguồn gốc bản địa và mối quan hệ di truyền giữa các giống với nhau. Điều đó gây ra không ít khó khăn trong việc bảo tồn, khai thác có hiệu quả kể cả thương mại các giống hoa trên thị trường trong nước và quốc tế. Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá quỹ gen là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục 2 vụ cho việc xác định các giống/loài khác nhau mà còn nhằm tìm hiểu mối quan hệ về di truyền giữa các giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen. Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu bảo tồn đa dạng sinh học. Ưu thế của các kỹ thuật phân tử là có khả năng xác định được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị bảo tồn của loài và quần thể. Những thông tin từ việc đánh giá sẽ được sử dụng hiệu quả trong các chương trình chọn tạo giống và làm cơ sở để thực hiện quyền sở hữu trí tuệ và các hợp đồng thương mại về sản phẩm đặc sản. Chính vì vậy, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (DNA fingerprinting) của các giống/loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền quốc gia về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc xác định bản quyền đối với giống cây trồng và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về tên các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam nói chung và lan Hoàng Thảo nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học và thực tiễn cao, không chỉ phục vụ cho lợi ích trước mắt mà còn định hướng mục tiêu lâu dài trong công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ thương mại hóa và phát triển cho đất nước. cơ sở , chúng tôi nh đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam”. 2. Mục tiêu của luận án - Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới. - Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ liệu cho xây dựng ADN mã vạch. 3 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo bản địa, là cơ sở để tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới; - Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc nhận dạng một số giống/loài lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam, làm cơ sở cho công tác bảo tồn, lưu giữ các nguồn gen quý, có giá trị kinh tế và đăng kí trên ngân hàng gen thế giới. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài góp phần thu thập và lưu giữ các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam; - góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo quý hiếm của Việt Nam bảo tồn, Phong l . 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu - Là các mẫu giống giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các vùng miền Việt Nam. 4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm được triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội. - Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014. 5. Những đóng góp của luận án Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ thống 4 về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm của Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS. Kết quả của luận án có ý nghĩa trong việc phân loại, phục vụ cho việc bảo tồn, , cao thư phong l . 5 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về chi lan Hoàng Thảo 1.1.1. Hệ thống phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) thuộc họ lan hay họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida), ngành thực vật hạt kín Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật (Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch và cs., 2009; Evans và cs., 2012). Dendrobium : D . Tên gọi Dendrobium đã được nhà thực vật người Thụy Điển Swartz đưa ra lần đầu tiên vào năm 1799 trong “Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis 6”. Từ đó đến nay hầu hết các nhà nghiên cứu hoa lan đều dùng tên gọi này (Dương Đức Huyến, 2007). Tuy nhiên, từ trước đó Loureiro đã công bố hai loài có tên gọi là Ceraia simplicissima và Callista amabilis trong “Flora Cochinchinensis” (1970) mà các nhà nghiên cứu sau này xếp vào chi Dendrobium. Tên gọi Ceraia và Callista ít được quan tâm nên sau này nó trở thành tên đồng nghĩa của Dendrobium (Dressler, 1993). Đại đa số các nhà phân loại như Lindley (1830), Reichenbach (1861), Bentham và Hooker (1883), Pfitzer (1890), Holttum (1953), Seidenfaden (1985) đều chia Dendrobium thành các nhóm khác