Luận án Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN VĂN NÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM HÀ NỘI – 2017 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Trần Văn Nên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN PGS. TS. NGUYỄN VĂN THANH HÀ NỘI, NĂM 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm Tác giả luận án Trần Văn Nên ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. TS. Nguyễn Thị Lan và PGS. TS. Nguyễn Văn Thanh đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Bệnh viện thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 20... Tác giả luận án Trần Văn Nên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. ii MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... ix TRÍCH YẾU LUẬN ÁN ................................................................................................ xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................. 1 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 2 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 2 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 3 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................................ 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................... 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................... 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC ............. 4 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nƣớc .......................................................... 4 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nƣớc .......................................................... 5 2.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUT CARE ............................................................... 7 2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care ................................................................................ 7 2.2.2. Hình thái của virus Care ......................................................................................... 8 2.2.3. Cấu trúc của virus Care ........................................................................................... 8 2.2.4. Sức đề kháng của virus Care ................................................................................... 9 2.2.5. Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................................... 9 2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care .......................................................................... 11 2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care ............................................................. 13 2.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE .............................................................. 18 2.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care ........................................................................... 18 2.3.2. Triệu chứng bệnh tích ........................................................................................... 20 iv 2.3.3. Chẩn đoán bệnh Care ............................................................................................ 22 2.3.4. Phòng và điều trị bệnh .......................................................................................... 27 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 31 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 31 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................................................................................... 31 3.3. ĐỐI TƢỢNG VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .............................................................. 31 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................... 33 3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care ........................... 33 3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........... 33 3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus Care phân lập đƣợc .......................................................................................................................... 34 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 34 3.5.1. Phƣơng pháp khám lâm sàng ................................................................................ 34 3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể .............................................. 34 3.5.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản ................... 35 3.5.4. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ............................................................... 38 3.5.5. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu máu ........................................................... 39 3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ................................................................................ 39 3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST .................. 40 3.5.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) ............................................... 41 3.5.9. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus............................. 41 3.5.10. Phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus Care .................................. 41 3.5.11. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................................... 42 3.5.12. Phƣơng pháp RT-PCR và PCR ........................................................................... 42 3.5.13. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene .................... 45 3.5.14. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 48 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 49 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE .................................................................................................................. 49 4.1.1. Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phƣơng pháp RT-PCR ................... 49 4.1.2. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care ..................................................... 50 4.1.3. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của các giống chó mắc bệnh Care 52 4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của các giống chó mắc bệnh Care ................ 55 v 4.1.5. Biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care .................................................. 60 4.1.6. Biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care ................................................. 62 4.1.7. Kết quả ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để xác định sự phân bố virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh ........................................................................... 67 4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC ................................................................. 70 4.2.1. Thông tin của những chủng virus Care phân lập đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ............ 70 4.2.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........... 70 4.2.3. Hiệu giá của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........................................... 73 4.2.4. Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trƣởng của những chủng virus Care phân lập đƣợc . 74 4.2.5. Nghiên cứu về tính kháng nguyên của chủng virus Care phân lập đƣợc .............. 79 4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC ................................................. 84 4.3.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu ............................. 84 4.3.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu .............. 85 4.3.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên cứu ............... 90 4.3.4. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu 98 4.3.5. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa những chủng virus nghiên cứu ....................................................................................................................... 99 4.3.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử .............................................................. 101 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 106 5.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................ 106 5.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 109 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 119 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó) CPE Cytophathogenic Effect (khả năng gây bệnh tích tế bào) CPV Canine Parvovirus (Virus gây bệnh Parvo ở chó) RNA Ribonucleic acid (Axít ribonucleic) DAB 3,3-diaminobenzidine DNA Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic) EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (axít etylen diamin tetraaxetic) ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phƣơng pháp miễn dịch gắn enzyme) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) FCS Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê) MOI Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngƣợc) SLS Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu) TCID50 Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm 50% trên môi trƣờng nuôi cấy mô) vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra .................................. 7 2.2. Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care đƣợc lƣu hành ở Việt Nam ............... 29 3.1. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H .......................... 33 3.2. Chó mắc bệnh Care theo giống chó khác nhau ........................................................ 31 3.3. Chó mắc bệnh Care theo các địa phƣơng nghiên cứu khác nhau ............................ 32 3.4. Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng cây sinh học phân tử ......................... 46 4.1. Kết quả chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR và PCR ........................................ 49 4.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care ........................................... 50 4.3. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care .............................. 52 4.4. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó H’Mông Cộc mắc bệnh Care ........................ 53 4.5. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care .................................. 53 4.6. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care ............................. 53 4.7. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Fox mắc bệnh Care ....................................... 53 4.8. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care ............................. 53 4.9. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care ................................ 55 4.10. Một số chỉ tiêu máu của giống chó H’Mông Cộc mắc bệnh Care ......................... 55 4.11. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care .................................. 56 4.12. Một số chỉ tiêu máu của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care .............................. 56 4.13. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Fox mắc bệnh Care ........................................ 57 4.14. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care ............................. 57 4.15. Các tổn thƣơng đại thể ở chó mắc Care ................................................................. 60 4.16. Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chó mắc bệnh Care ..................................... 63 4.17. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch ......................................................................... 67 4.18. Thông tin của các chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu ............................. 70 4.19. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 chủng virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort .................................................................................. 71 4.20. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu .......................... 73 4.21. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng kháng thể của 6 chó thí nghiệm trƣớc khi tiêm vacxin Care vô hoạt .................................................................................................................... 80 viii 4.22. Các triệu chứng lâm sàng của các chó thí nghiệm sau khi công cƣờng độc .......... 83 4.23. Kết quả phân lập virus CDV ở các lô chó thí nghiệm ........................................... 84 4.24. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa những chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin .......................................................................................................... 87 4.25. Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa những chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin .......................................................................................................... 88 4.26. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin .............................................................................................. 97 4.27. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin .............................................................................................. 97 4.28. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene H giữa những chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) .............................................................. 99 4.29. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene P giữa những chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) .............................................................. 99 4.30. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene H giữa những chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) ........................................................................ 100 4.31. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene P giữa những chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) ........................................................................ 101 ix DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Cấu trúc của virus Care .............................................................................................. 8 2.2. Cơ chế sinh bệnh của bệnh Care. ............................................................................. 10 2.3. Bệnh tích tế bào do chủng virus CDV4-H và Onderstepoort gây ra sau 36 và 48 giờ gây nhiễm trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero-DST .................................................. 12 2.4. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus vacxin Onderstepoort và chủng 007Lm ............................................................................................................................. 13 2.5. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care ................................ 16 2.6. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene P của virus Care ................................. 17 2.7. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch trên tiêu bản phổi, hạch lympho, não và dạ dày (IHC. 10X) ...................................................................................................................... 25 4.1. Chó tiêu chảy, phân màu cà phê .............................................................................. 52 4.2. Chó có biểu hiện thần kinh ...................................................................................... 52 4.3. Chó mắc bệnh Care có các nốt sài ở vùng da mỏng. ............................................... 52 4.4. Chó mắc bệnh Care có gan bàn chân sƣng, cứng .................................................... 52 4.5. Xuất huyết ở phổi ..................................................................................................... 62 4.6. Ruột bị sung huyết ................................................................................................... 62 4.7. Hạch dƣới hàm sƣng to ............................................................................................ 62 4.8. Hạch màng treo ruột sƣng to ............................................................................