Luận án Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan nghệ tâm, hạc vỹ của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM (Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM (Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 9 62 01 10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Vũ Mạnh Hải 2. TS. Phạm Hương Sơn HÀ NỘI - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS. Vũ Mạnh Hải và TS. Phạm Hương Sơn, sự giúp đỡ của lãnh đạo, cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ; Trung tâm Tài nguyên thực vật. Các thông tin trích dẫn sử dụng trong luận án đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thị Lài ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy, cô giáo, các tập thể, cá nhân cùng bạn bè đồng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Vũ Mạnh Hải và TS. Phạm Hương Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện luận án. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo, các cán bộ nghiên cứu Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ, Trung tâm Tài nguyên thực vật, Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên khích lệ, giúp đỡ về vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thị Lài iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................ ix MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4 1.1 Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) của Việt Nam .................................................................................. 4 1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) .................................................................................. 4 1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) .............. 5 1.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ở Việt Nam ................................................................... 6 1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam .......................................................................................................... 7 1.5.1 Sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới ............... 7 1.5.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam ......... 8 1.6 Cơ sở khoa học về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo ................................. 9 1.6.1 Bảo tồn hoa lan ............................................................................................ 9 1.6.2 Các kỹ thuật về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo hoa lan ................. 10 1.7 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam ......................................................................................... 20 1.7.1 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới ................................................................................................................ 20 1.7.2 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam ............................................................................................................ 33 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................... 39 NGHIÊN CỨU ................................................................................................................... 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 39 2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 41 iv 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ......................................................................................... 41 2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro, kỹ thuật tạo hạt nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) phục vụ cho công tác bảo tồn ................................................ 41 2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm .................................................. 42 2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) giai đoạn vườn sản xuất .................................................................... 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 43 2.4 Các chỉ tiêu theo dõi ....................................................................................... 52 2.5 Điều kiện thí nghiệm ....................................................................................... 53 2.6 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 54 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................ 55 3.1 Đặc điểm sinh học của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ........................................................................................................ 55 3.1.1 Đặc điểm hình thái học của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ .............................. 55 3.1.2 Cấu tạo vi phẫu của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ .............................. 59 3.1.3 Một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ................................................................................................ 67 3.2 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro, tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) .............................................................. 69 3.2.1 Xác định chất khử trùng và thời gian khử trùng của mẫu nuôi cấy .......... 69 3.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu protocorm like bodies (PLBs) từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) .............................................................................................. 71 3.2.3 Tái sinh chồi từ protocorm like bodies (PLBs) ......................................... 74 3.2.4 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh .................................................... 79 3.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo........................................................ 84 3.2.6 Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo .............................................. 90 3.2.7 Nghiên cứu khả năng nhân giống in vitro của hạt nhân tạo sau bảo quản 99 3.2.8 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh từ hạt hạt nhân tạo sau bảo quản .................................................................................................................. 103 3.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm ................................................. 108 v 3.3.1 So sánh sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản ..................................................... 109 3.3.2 Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai đoạn vườn ươm .................................................................................................................. 111 3.3.3 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn ươm .................................................................................................................. 112 3.3.4 Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn ươm ......................................................................................................... 115 3.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) giai đoạn vườn sản suất ............................................................... 118 3.4.1 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây ở giai đoạn vườn sản xuất ............ 118 3.4.2 Nghiên cứu chế độ dinh dưỡng cho cây lan ở giai đoạn vườn sản suất .. 120 3.4.3 Nghiên cứu bổ sung Superthrive cho cây lan ở giai đoạn vườn sản xuất ................................................................................................................... 122 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................................. 128 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 131 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 148 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid ADN Axit DeoxyriboNucleic BA 6-Benzylaminopurine CITES Convention on International Trade in Endangered Species CV (%) Hệ số biến động (Coeffient of Variants) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetate FDA Fluorescein Diacetate HV Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) IBA Indole Butyric Acid IUCN International Union for Conservation of Nature 2iP 2-isopentyl Adenine αNAA α-Naphthalene Acetic Acid Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine) KC Knudson C (1946) LSD Least significiant difference (Sai số tối thiểu có ý nghĩa) MS Murashige and Skoog (1962) ND New Dogashima (1998) NT Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) OD Optical Density PAA Phenoxy Acetic Acid PLBs Protocorm like bodies SH Schenk and Hildebrandt (1972) TCLs Thin cell layers – Các lát mỏng tế bào tTCL Traverse thin cell layer- Lát mỏng tế bào nằm ngang TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) TTC Tetrazolium TNDTTV Tài nguyên di truyền thực vật THT Than hoạt tính UNCED United Nations Conference on Environment and Development (Hội nghị Liên Hiệp quốc về môi trường và phát triển) VW Vacin and Went (1949) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu .................................. 4 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái rễ, lá và thân của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ................. 56 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái hoa của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ................... 57 Bảng 3.3 Kích thước các lớp mô trong cấu tạo vi phẫu rễ Nghệ tâm và Hạc vỹ ...... 61 Bảng 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................ 63 Bảng 3.5 Cấu tạo vi phẫu lá Nghệ tâm và Hạc vỹ .................................................... 64 Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số thành phần hóa sinh cơ bản có trong hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ....................................................................................... 68 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl lên mẫu cấy .......................... 69 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chất kháng sinh cefotaxime (cef) và 3% NaOCl đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy ................................................................ 70 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của BA .................................................................................... 72 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) đến khả năng tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) ................................................................................ 73 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 75 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngô đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 76 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của bột tảo Spirulina đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs ... 77 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ in vitro ................................................................................................................. 79 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ chồi Nghệ tâm và Hạc vỹ .... 80 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sodium alginate và CaCl2.2H2O đến sự hình thành vỏ hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ...................................... 86 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) đến tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................... 86 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm và khả năng sinh trưởng của hạt nhân tạo ....................... 87 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của BA, tổ hợp BA + IBA đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo .................................................................................. 89 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo .......... 91 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lan Nghệ tâm ......................................................................................................... 93 viii Bảng 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lan Hạc vỹ ............................................................................................................. 94 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng sống sót của hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm ................................... 96 Bảng 3.24 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng sống sót của hạt nhân tạo sau bảo quản lan Hạc vỹ ........................................ 97 Bảng 3.25 Ảnh hưởng của tổ hợp BA + PAA đến quá trình nhân nhanh protocorm và chồi sau bảo quản .......................................................................................... 100 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm và chồi của hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản .......................................... 102 Bảng 3.27 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi ............................... 104 Bảng 3.28 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản ............................................................ 109 Bảng 3.29 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm ............................................................ 111 Bảng 3.30 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm ............................................................................................. 113 Bảng 3.31 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng khác nhau đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm......................................... 116 Bảng 3.32 Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất .................................................................... 118 Bảng 3.33 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm giai đoạn vườn sản suất ................................................... 120 Bảng 3.34 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của lan Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất .............................................................. 121 Bảng 3.35 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến khả năng khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm ở giai đoạn vườn sản suất .................................... 123 Bảng 3.36 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến khả năng khả năng sinh trưởng của lan Hạc vỹ ở giai đoạn vườn sản suất ......................................... 124 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây hoa lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................................. 5 Hình 3.1 Thân, lá và rễ cây Nghệ tâm (D. loddigesii) .............................................. 55 Hình 3.2 Thân, lá và rễ cây Hạc vỹ (D. aphyllum) ................................................... 55 Hình 3.3 Lát cắt ngang qua rễ Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................. 60 Hình 3.4 Lát cắt ngang qua thân Nghệ tâm và Hạc vỹ ............................................. 62 Hình 3.5 Lát cắt ngang qua lá Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................. 64 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái và cấu tạo hoa của Nghệ tâm và Hạc vỹ ..................... 66 Hình 3.7 Mẫu nảy chồi sau 6 tuần nuôi cấy .............................................................. 71 Hình 3.8 Khả năng phát sinh PLBs từ tTCL ............................................................. 74 Hình 3.9 Tái sinh chồi từ PLBs ................................................................................. 78 Hình 3.10 Tạo cây lan Nghệ tâm in vitro hoàn chỉnh ............................................... 81 Hình 3.11 Tạo cây lan Hạc vỹ in vitro hoàn chỉnh ................................................... 81 Hình 3.12 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Nghệ tâm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào .................................................................................................. 83 Hình 3.13 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Hạc vỹ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào ......................................................................................................... 84 Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo ............................................................... 88 Hình 3.15 A - protocorm like bodies; B, C - hạt nhân tạo; D - Hạt nhân tạo được bảo quản (sau 24 tuần) ........................................................................................... 98 Hình 3.16 Sơ đồ tóm tắt quy trình tạo hạt giống nhân tạo hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ............................................................................................................. 99 Hình 3.17 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm của hạt nhân tạo sau quá trình bảo quả