Luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài chloranthus japonicus sieb. ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ĐỖ THỊ OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI CHLORANTHUS JAPONICUS SIEB. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ĐỖ THỊ OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI CHLORANTHUS JAPONICUS SIEB. Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành : DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN Mã số : 9720206 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Phạm Thanh Kỳ 2. TS. Lê Việt Dũng HÀ NỘI, NĂM 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ------o0o------ ĐỖ THỊ OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI CHLORANTHUS JAPONICUS SIEB. Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN Mã số : 9720206 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Thanh Kỳ và PGS.TS. Lê Việt Dũng. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. HàNội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Đỗ Thị Oanh LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nỗ lực để hoàn thành luận án, là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình đến các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nhà khoa học đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Nhà Giáo Nhân Dân GS.TS. Phạm Thanh Kỳ - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Việt Dũng, TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, PGS.TS. Phương Thiện Thương – Viện Dược liệu đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành Luậnán. Tôi cũng xin cảm ơn BGĐ Bệnh viện YHCT TW đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng tôi xin bày tỏ ng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kính yêu, những người thân trong gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và sự nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! HàNội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Đỗ Thị Oanh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALT AST BuOH BV Hx 13C- NMR Alanin amino transferase Aspartat amino transferase Butanol Bảo vệ n-hexan Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H -NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy DC Dl DMSO Dịch chiết Dược liệu Dimethylsulfoxide DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer ESI-MS EtOAc EtOH Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry Ethyl acetat Ethanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HPLC Hight pressure Liquid Chrom atography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) IR KH Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Khoa học Me Nhóm metyl MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) MDA NC Malondialdehyd Nghiên cứu PĐ Phân đoạn PAR SN SKC SKLM CTPT Paracetamol Sói nhật Sắc ký cột Column Chromatography Sắc ký lớp mỏng Công thức phân tử TD TLC TLTK TPCN TT  (ppm) s d dd t m ttc TMĐ VDL HNIP NH HNU Tác dụng Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Tài liệu tham khảo Thực phẩm chức năng Thuốc thử Độ dịch chuyển hóa học (parts per milion). singlet doublet double of doublet triplet multiplet Thể trọng chuột Trên mặt đất Viện dược liệu Đại học dược Hà Nội Viện sinh thái tài nguyên sinh vật Đại học khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG TT Số bảng Tên bảng Trang 1. Bảng 1.1 Các eudesmane sesquiterpen phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 9 2. Bảng 1.2 Các lindenan sesquiterpen phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 13 3. Bảng 1.3 Các sesquiterpen khác phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 17 4. Bảng 1.4 Các diterpenoid phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 19 5. Bảng 1.5 Các triterpenoid phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 23 6. Bảng 1.6 Các flavonoid phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 24 7. Bảng 1.7 Các coumarin phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 24 8. Bảng 1.8 Các acid hữu cơ phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 24 9. Bảng 1.9 Các lignan phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 25 10. Bảng 1.10 Các sterol khác phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 25 11. Bảng 1.11 Các chất khác phân lập từ các loài trong chi Chloranthus 25 12. Bảng 1.12 Các eudesmane sesquiterpen phân lập từ loài C. japonicus 26 13. Bảng 1.13 Các lindenan sesquiterpen phân lập từ loài C. japonicus 27 14. Bảng 1.14 Các sesquiterpen khác phân lập từ loài C. japonicus 29 15. Bảng 1.15 Các coumarin phân lập từ loài C. japonicus 30 16. Bảng 1.16 Các acid hữu cơ phân lập từ loài C. japonicus 30 17. Bảng 1.17 Các lignan phân lập từ loài C. japonicus 30 18. Bảng 1.18 Các sterol phân lập từ loài C. japonicus 31 19. Bảng 1.19 Các chất khác phân lập từ C. japonicus 31 20. Bảng 3.1 Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong cây Sói nhật 58 21. Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 1-2 62 22. Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 3 64 23. Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 4 65 24. Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz)chất số 5 67 25. Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 7 72 26. Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 8 73 27. Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 9 75 28. Bảng 3.9 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 10 77 29. Bảng 3.10 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 11 79 30. Bảng 3.11 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 12 83 31. Bảng 3.12 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 13 85 32. Bảng 3.13 Số liệu phổ 1H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) chất số 14 86 33. Bảng 3.14 Tỷ lệ chuột chết ở các lô chuột uống SN 88 34. Bảng 3.15 Tác dụng chống viêm của SN (phần TMĐ) trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin 89 35. Bảng 3.16 Tác dụng chống viêm của SN (phần rễ) trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin 89 36. Bảng 3.17 Ảnh hưởng của SN đến thể tích dịch rỉ viêm (phần TMĐ) 90 37. Bảng 3.18 Ảnh hưởng của SN đến thể tích dịch rỉ viêm (phần rễ) 90 38. Bảng 3.19 Ảnh hưởng của SN đến số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm (phần TMĐ) 90 39. Bảng 3.20 Ảnh hưởng của SN đến số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm (phần rễ) 91 40. Bảng 3.21 Ảnh hưởng của SN đến hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm (phần TMĐ) 91 41. Bảng 3.22 Ảnh hưởng của SN đến hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm (phần rễ) 91 42. Bảng 3.23 Tác dụng của cao SN lên trọng lượng u hạt (phần TMĐ) 92 43. Bảng 3.24 Tác dụng của cao SN lên trọng lượng u hạt (phần rễ) 92 44. Bảng 3.25 Ảnh hưởng của cao SN (phần TMĐ) lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng paracetamol 93 45. Bảng 3.26 Ảnh hưởng của cao SN (phần TMĐ) lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng paracetamol 93 46. Bảng 3.27 Ảnh hưởng của cao SN (phần TMĐ) lên hàm lượng MDA dịch đồng thể gan 93 47. Bảng 3.28 Ảnh hưởng của cao SN (phần rễ) lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột bị gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol 94 48. Bảng 3.29 Ảnh hưởng của cao SN (phần rễ) lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột bị gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol 94 49. Bảng 3.30 Ảnh hưởng của cao SN(phần rễ) lên hàm lượng MDA dịch đồng thể gan 95 50. Bảng 3.31 Hoạt tính ức chế enzym protease HIV-1 của hợp chất SN2 96 51. Bảng 4.1 Vị trí phân loại chi Chloranthus Sw. theo 4 hệ thống phân loại 97 DANH MỤC HÌNH STT Số hình Tên hình Trang 1. Hình 1.1 Một số dạng lá 5 2. Hình 1.2 Vị trí của cụm hoa 6 3. Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 39 4. Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất phần trên mặt đất cấy Sói nhật 42 5. Hình 2.3 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ rễ cây Sói nhật 44 6. Hình 3.1 (1) Tiêu bản cây Sói nhật thu hái tại Lâm Đồng (6/2012), (2) Tiêu bản cây Sói nhật thu hái tại Vĩnh Phúc (27/4/2012) lưu tại Viện Dược liệu 50 7. Hình 3.2 Cây Sói nhật tại Đà lạt - Lâm Đồng (7/01/2012) 51 8. Hình 3.3 Cây Sói nhật mọc rải rác dưới tán rừng thông lá kim 51 9. Hình 3.4 Đặc điểm hình thái cơ quan sinh trưởng của cây Sói nhật 52 10. Hình 3.5 Đặc điểm hình thái cơ quan sinh sản của cây Sói nhật 53 11. Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu rễ cây Sói nhật. 54 12. Hình 3.7 Đặc điểm vi phẫu thân cây Sói nhật 55 13. Hình 3.8 Đặc điểm vi phẫu lá cây Sói nhật 55 14. Hình 3.9 Đặc điểm bột phần trên mặt đất cây Sói nhật 56 15. Hình 3.10 Đặc điểm bột rễ cây Sói nhật 57 16. Hình 3.11 Công thức cấu tạo chất số 1 60 17. Hình 3.12 Phổ 1H –NMR của chất số 1 60 18. Hình 3.13 Phổ 13C-NMR của chất số 1 61 19. Hình 3.14 Phổ DEPT của chất số 1 61 20. Hình 3.15 Công thức cấu tạo chất số 2 62 21. Hình 3.16 Công thức cấu tạo chất số 3 64 22. Hình 3.17 Cấu trúc hóa học chất số 4 66 23. Hình 3.18 Cấu trúc hóa học chất số 5 68 24. Hình 3.19 Cấu trúc hóa học chất số 6 69 25. Hình 3.20 Phổ (+) MS của chất số 6 69 26. Hình 3.21 Phổ 1H –NMR của chất số 6 70 27. Hình 3.22 Phổ 13C-NMR của chất số 6 70 28. Hình 3.23 Phổ DEPT của chất số 6 71 29. Hình 3.24 Cấu trúc hóa học chất số 7 72 30. Hình 3.25 Cấu trúc hóa học chất số 8 74 31. Hình 3.26 Cấu trúc hóa học chất số 9 76 32. Hình 3.27 Cấu trúc hóa học chất số 10 78 33. Hình 3.28 Cấu trúc hóa học chất số 11 80 34. Hình 3.29 Phổ 13C-NMR của chất số 11 81 35. Hình 3.30 Phổ DEPT của chất số 11 81 36. Hình 3.31 Phổ HMBC của chất số 11 82 37. Hình 3.32 Phổ HSQC của chất số 11 82 38. Hình 3.33 Cấu trúc hóa học chất số 12 84 39. Hình 3.34 Phổ HSQC của chất số 12 84 40. Hình 3.35 Cấu trúc hóa học chất số 13 86 41. Hình 3.36 Cấu trúc hóa học chất số 14 87 42. Hình 3.37 Đồ thị tương quan giữa liều dùng SN với tỉ lệ chuột chết theo đường uống 88 43. Hình 3.38 Đồ thị thể hiện hoạt tính ức chế của SN2 đối với protease HIV-1 96 44. Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của 14 hợp chất đã phân lập được từ cây Sói nhật 101 45. Hình 4.2 Hoạt tính ức chế của SN2 (A) và acid maslinic (B) đối với protease HIV-1 113 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA HỌ HOA SÓI (CHLORANTHACEAE) VÀ CHI CHLORANTHUS SW. ............................................ 3 1.1.1 Vị trí phân loại ................................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật của họ Hoa sói (Chloranthaceae), chi Chloranthus Sw. ..... 4 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật họ Hoa sói (Chloranthaceae) ...................................... 4 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật chi Chloranthus Sw. ................................................... 8 1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CHI CHLORANTHUS SW. .............................. 8 1.2.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI TRONG CHI CHLORANTHUS SW. ................................................................................................. 9 1.2.1.1. Nhóm chất terpenoid ................................................................................ 9 1.2.1.2. Các phenolic ........................................................................................... 24 1.2.1.3. Sterol ...................................................................................................... 25 1.2.1.4. Các chất khác.......................................................................................... 25 1.2.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LOÀI C. JAPONICUS SIEB. .................. 26 1.2.2.1. Nhóm chất terpenoid .............................................................................. 26 1.2.2.2. Các phenolic ........................................................................................... 30 1.2.2.3. Sterol ...................................................................................................... 31 1.2.2.4. Các chất khác.......................................................................................... 31 1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHI CHLORANTHUS SW .................................. 32 1.3.1 Tác dụng sinh học của các loài trong chi Chloranthus Sw. ............................. 32 1.3.1.1. Tác dụng chống ung thư ......................................................................... 32 1.3.1.2. Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm .................................................... 33 1.3.1.3. Tác dụng chống viêm và bảo vệ gan ...................................................... 33 1.3.1.4. Các tác dụng khác................................................................................... 34 1.3.2. Tác dụng sinh học của loài C. japonicus Sieb................................................. 34 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 36 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................. 36 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu .................................................................................. 36 2.1.2. Động vật thí nghiệm ........................................................................................ 36 2.1.3. Thiết bị và hóa chất ......................................................................................... 36 2.1.3.1. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật ....................................................................................................... 36 2.1.3.2. Các thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học ..... 37 2.1.3.3. Các thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu tác dụng sinh học ........ 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 38 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật ................................................... 38 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu về hóa học .............................................................. 40 2.2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu .............................. 40 2.2.2.2. Chiết xuất ............................................................................................... 40 2.2.2.3. Phân lập các chất .................................................................................... 40 2.2.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ....................................... 45 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học ................................................... 45 2.2.3.1. Thử độc tính cấp ..................................................................................... 45 2.2.3.2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm ........................................................... 45 2.2.3.3. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa ............................... 47 2.2.3.4. Thử hoạt tính ức chế protease HIV-1 của chất tinh khiết đã phân lập được ..................................................................................................................... 49 2.2.4. Xử lý số liệu .................................................................................................... 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 50 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT ......................................................... 50 3.1.1. Thẩm định tên khoa học cây Sói nhật ............................................................. 50 3.1.2. Đặc điểm hình thái cây Sói nhật ..................................................................... 50 3.1.3. Đặc điểm giải phẫu cây Sói nhật ..................................................................... 54 3.1.3.1 Đặc điểm giải phẫu rễ .............................................................................. 54 3.1.3.2. Đặc điểm giải phẫu thân ......................................................................... 54 3.1.3.3. Đặc điểm giải phẫu lá ............................................................................. 55 3.1.3. Đặc điểm bột phần trên mặt đất và rễ cây Sói nhật......................................... 56 3.1.3.1. Đặc điểm bột phần trên mặt đất cây Sói nhật ........................................ 56 3.1.3.2. Đặc điểm bột rễ cây Sói nhật ................................................................. 57 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................ 58 3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Sói nhật ....................................... 58 3.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập các chất .......................................................... 59 3.2.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ............................................... 59 3.2.3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ phần TMĐ cây Sói nhật ...................................................................................................................... 59 3.2.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ rễ cây Sói nhật ......... 66 3.3. ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY SÓI NHẬT ...................... 87 3.3.1. Độc tính cấp .................................................................................................... 87 3.3.1.1. Độc tính cấp của cao chiết nước phần TMĐ cây Sói nhật ..................... 87 3.3.1.2. Độc tính cấp của cao chiết nước phần rễ cây Sói nhật ........................... 87 3.3.2. Tác dụng chống viêm ...................................................................................... 88 3.3.2.1. Tác dụng chống viêm cấp ....................................................................... 88 3.3.2.2. Tác dụng chống viêm mạn ..................................................................... 91 3.3.3. Tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa ......................................................... 92 3.3.3.1. Tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa của cao Sói nhật (phần TMĐ) 92 3.3.3.2. Tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa của cao Sói nhật (phần rễ) ...... 94 3.3.4. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của chất tinh khiết SN2 .............................. 95 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................... 96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 114 PHỤ LỤC 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nguồn dược liệu tự nhiên phong phú và đa dạng về chủng loại lẫn công dụng làm thuốc. Đồng thời, Việt Nam có một nền y học cổ truyền dân tộc lâu đời với các tri thức sử dụng các loại dược liệu, các bài thuốc có giá trị dùng để phòng bệnh và chữa bệnh. Hiện nay, không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, với xu hướng “trở về với thiên nhiên” nên việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu của người dân ngày càng gia tăng, vì ít có những tác dụng không mong muốn và giá thành phù hợp hơn. Để đảm bảo tính khoa học, hiệu quả, an toàn cho việc sử dụng các cây thuốc, các bài thuốc trong nhân dân thì việc nghiên cứu về chúng ngày càng được quan tâm. Cây Sói nhật, còn gọi là Kim túc lan, Tứ khôi ngõa, Hom sam mườ