Luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ nho (Vitaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem. & Schult.), HỌ NHO (VITACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem. & Schult.), HỌ NHO (VITACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Người hướng dẫn khoa học : 1. PGS.TS. Đỗ Thị Hà 2. TS. Hà Vân Oanh HÀ NỘI, 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đỗ Thị Hà và TS. Hà Vân Oanh. Kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án NCS. Phùng Thanh Long LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô giáo, các Nhà khoa học từ nhiều đơn vị, cùng đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà và TS. Hà Vân Oanh, hai người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thế Cường, TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế, TS. Trần Thị Hiền cùng các thầy cô giáo, các nhà khoa học công tác tại Viện Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, Phòng Khoa học và Đào tạo, thư viện Viện Dược liệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Luận án được hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu cơ chế tác dụng chống viêm của một số hợp chất oligostilbenoid phân lập từ các loài Nho dại (Vitis sp.) thu hái ở miền bắc Việt Nam, mã số 106.YS.05-2014.26”, do đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận án này. Lời sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên và chia sẻ giúp tôi đạt được kết quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! NCS. Phùng Thanh Long MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về chi Nho Vitis L. ................................................................................. 3 1.1.1. Thực vật ................................................................................................................. 3 1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................................... 5 1.1.3. Tác dụng sinh học ................................................................................................ 27 1.2. Tổng quan về loài Nho rừng ................................................................................... 36 1.2.1. Đặc điểm thực vật của Nho rừng ......................................................................... 36 1.2.2. Thành phần hóa học của Nho rừng ...................................................................... 37 1.2.3. Tác dụng và công dụng của Nho rừng ................................................................. 39 1.3. Tổng quan về viêm ................................................................................................ 40 1.3.1. Khái niệm viêm .................................................................................................... 40 1.3.2. Các chất trung gian trong phản ứng viêm ............................................................ 40 1.3.3. Một số mô hình đánh giá tác dụng chống viêm ................................................... 45 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 49 2.1. Đối tượng nghiên cứu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ ................................................. 49 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 49 2.1.2. Nguyên liệu.......................................................................................................... 49 2.1.3. Động vật thực nghiệm ......................................................................................... 49 2.1.4. Thuốc thử, hóa chất, dung môi ............................................................................ 49 2.1.5. Máy móc, thiết bị ................................................................................................. 50 2.2. Địa điểm nghiên cứu............................................................................................... 51 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu thực vật.............................................................................. 51 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu hóa học .............................................................................. 51 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu tác dụng sinh học .............................................................. 51 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 52 2.3.1. Thu thập, xử lý mẫu nghiên cứu ...................................................................... 52 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực vật học ................................................................ 52 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học ..................................................... 52 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu một số tác dụng sinh học ............................................ 52 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 59 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật ................................................................... 59 3.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học ................................................... 59 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu ................................................................................................. 61 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu........................................................................................ 63 3.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học ................................................................ 65 3.2.1. Kết quả định tính ................................................................................................. 65 3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất ................... 66 3.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học .................................................................. 100 3.3.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm ......................................................... 100 3.3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau ............................................................. 106 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................... 108 4.1. Về thực vật ............................................................................................................ 108 4.2. Về hóa học ............................................................................................................ 109 4.2.1. Về định tính ....................................................................................................... 110 4.2.2. Về chiết xuất và phân lập .................................................................................. 110 4.3. Về tác dụng chống viêm và giảm đau .................................................................. 118 4.3.1. Tác dụng chống viêm in vitro ............................................................................ 118 4.3.2. Tác dụng chống viêm và giảm đau in vivo ....................................................... 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 126 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 126 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 127 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..................................................... DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải thích AA Acid arachidonic Akt Proteinkinase B AMPK Adenosin monophosphat-activated protein kinase AP-1 Activator protein -1 ATF Activating transcription factor (yếu tố hoạt hóa phiên mã) Chuột SHR Spontaneously hypertensive rat (một dòng chuột được phát triển để nghiên cứu về bệnh cao huyết áp) COX Cyclooxygenase COSY Correlated Spectroscopy (Phổ tương quan) DCM Dichloromethan DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI ElectroSpray Ionisation (kỹ thuật ion hóa phun mù điện) Glc β-ᴅ-glucopyranosyl GLUT 4 Glucose transporter type 4 HDL High density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan dị nhân đa liên kết) 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) HO-1 Heme oxygenase - 1 HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tương tác dị nhân lượng tử đơn) IKK IκB kinase IL Interleukin iNOS Inducible nitric oxide synthetase LDL Low density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng thấp) LPS Lipopolysaccharid MAPK Mitogen-activated protein kinase (Protein kinase hoạt hóa phân bào) MDA Malondialdehyd MMP Matrix metallopetidase MS Mass spectrometry (Phổ khối lượng) MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl) 2,5- diphenyl-tetrazolium bromid] NF-κB Nuclear factor kappa B (yếu tố nhân kappa B) NrF2 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 NO Nitric oxid NOS Nitric oxid synthase PGE2 Prostaglandin E2 PGHS Prostaglandin endoperoxid H synthase PI3K Phosphatidylinositide-3-kinase RNA Acid ribonucleic RNS Reactive nitrogen species (Các chất hoạt động chứa nitơ) ROS Reactive oxygen species (Các chất hoạt động chứa oxy) RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SIRT Sirtuin SOD Superoxide dismutase STT Số thứ tự TGF Tumor growth factor (yếu tố tăng trưởng khối u) TLR-4 Toll-like receptor 4 TLTK Tài liệu tham khảo TNF Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử khối u) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh thái và vùng phân bố của các loài Nho ở Việt Nam ............... 4 Bảng 1.2. Các monomer stilbenoid (1-13) phân lập từ các loài thuộc chi Nho .............. 7 Bảng 1.3. Các dimer stilbenoid (14-52) đã phân lập từ các loài thuộc chi Nho ............. 8 Bảng 1.4. Các trimer stilbenoid (53-71) phân lập từ các loài thuộc chi Nho ................ 13 Bảng 1.5. Các tetramer stilbenoid (72-96) phân lập từ các loài thuộc chi Nho ............ 15 Bảng 1.6. Các pentamer, hexamer stilbenoid (97-100) phân lập từ các loài thuộc chi Nho ....................................................................................................................................... 18 Bảng 1.7. Một số hợp chất flavonoid (101-134) được tìm thấy trong chi Nho ............. 20 Bảng 1. 8. Một số hợp chất phenol (135-146) khác thuộc chi Nho .............................. 24 Bảng 1.9. Một số hợp chất không phenol khác (164-175) phân lập từ chi Nho ........... 26 Bảng 1.10. Các hợp chất đã được phân lập từ loài Nho rừng V. heyneana................... 37 Bảng 3.1. Kết quả định tính phần trên mặt đất của loài Nho rừng ................................ 65 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH1 ........................................................... 70 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH2 ........................................................... 71 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH3 ........................................................... 72 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH4 ........................................................... 74 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH5 ........................................................... 76 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH6 ........................................................... 78 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH7 ........................................................... 79 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH8 ........................................................... 83 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ của hợp chất VH9 ................................................................... 88 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ của hợp chất VH10 ................................................................. 90 Bảng 3.12. Dữ liệu phổ của hợp chất VH11 ................................................................. 92 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ của hợp chất VH12 ................................................................. 94 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ của hợp chất VH13 ................................................................. 95 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ của hợp chất VH15 ................................................................. 97 Bảng 3.16. Dữ liệu phổ của hợp chất VH16 ................................................................. 98 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế COX-2 của cao ethanol 96% và 3 cao phân đoạn phần trên mặt đất Nho rừng ................................................................................ 100 Bảng 3.18. Tác dụng chống viêm cấp của cao VHE trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan ......................................................................................................... 105 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của VHE lên khối lượng u hạt ............................................... 106 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của cao VHE lên số cơn đau quặn ......................................... 106 Bảng 4.1. Các tác dụng sinh học của E-resveratrol ..................................................... 113 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chung của các monomer stilbenoid phân lập từ chi Nho .................. 6 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các monomer stilbenoid 1-13 phân lập từ chi Nho ....... 6 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các dimer stilbenoid 14-52 phân lập từ chi Nho ......... 12 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các trimer stilbenoid 53-71 phân lập từ chi Nho ........ 14 Hình 1.5. Cấu trúc khung của một số tetramer stilbenoid phân lập từ chi Nho ............ 15 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của một số tetramer stilbenoid 72-96 phân lập từ chi Nho ....................................................................................................................................... 18 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của các pentamer, hexamer stilbenoid 97-100 từ chi Nho 19 Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất phenol 135-146 khác ........................ 24 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của một số sterol 147-163 thuộc chi Nho ....................... 26 Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất không phenol khác 164-175 thuộc chi Nho ................................................................................................................................ 27 Hình 1.12. Sơ đồ cơ chế viêm theo con đường NF-κB [201], [202], [203] ................. 44 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của loài Nho rừng ........................................................... 60 Hình 3.2. Đặc điểm hoa của loài Nho rừng ................................................................... 60 Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân loài Nho rừng ............................................................ 62 Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá loài Nho rừng ................................................................ 63 Hình 3.5. Đặc điểm bột thân loài Nho rừng .................................................................. 64 Hình 3.6. Đặc điểm bột lá loài Nho rừng ...................................................................... 65 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH1 ............................................................. 70 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH2 ............................................................. 71 Hình 3.9. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH3 .... 72 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH4 .. 74 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH5 .. 76 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY (─), HMBC chính (→) của hợp chất VH6 ........................................................................................................................ 78 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH7 .. 79 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY, HMBC chính của hợp chất VH8 ....................................................................................................................................... 82 Hình 3.15. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH9 .. 88 Hình 3.16. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH10 90 Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH11 92 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH12 ......................................................... 94 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH13 ......................................................... 95 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH14 và VH15 .......................................... 96 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH16 ......................................................... 98 Hình 3.22. Ảnh hưởng của cao chiết ethanol 96% và 3 phân đoạn từ phần trên mặt đất Nho rừng lên mức độ biểu hiện COX-2 mRNA. ......................................................... 100 Hình 3.23. Ảnh hưởng của các hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng lên mức độ biểu hiện COX-2 và sự sản sinh PGE2 trên đại thực bào RAW264.7 ................................ 102 Hình 3.24. Ảnh hưởng của VH6 lên mức độ biểu hiện COX-2, iNOS ....................... 104 Hình 4.1. Giả thuyết cơ chế chống viêm của hợp chất VH6 ....................................... 121 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ phần trên mặt đất loài Nho rừng .......... 66 Sơ đồ 3. 2. Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat của loài Nho rừng (V. heyneana) ........................................................................................................ 68 Sơ đồ 3. 3. Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn n-hexan của loài Nho rừng (V. heyneana) ................................................................................................................. 69 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đất nước Việt Nam với 54 dân tộc cùng hàng ngàn năm lịch sử đã tích lũy được một kho tàng tri thức y học dân gian vô cùng phong phú. Nhiều cây thuốc đã được người dân địa phương sử dụng hiệu quả trong một thời gian dài nhưng lại rất ít phổ biến do chủ yếu được lưu truyền trong cộng đồng bằng hình thức truyền miệng. Ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam, loài Nho rừng hay còn gọi Nho lông hay Nho năm góc, có tên khoa học là Vitis heyneana Roem. & Schult. từ lâu đã được người dân sử dụng như một vị thuốc [1], [2]. Cây phân bố ở một số quốc gia Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Campuchia [1], [2], [3]. Ở nước ta, Nho