Luận án Nghiên cứu đột biến gen beta globin và chẩn đoán trước sinh bệnh beta thalassemia tại bệnh viện nhi trung ương

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÝ THỊ THANH HÀ LÝ THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC L LÝ THỊ THANH HÀ THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Vân Khánh Trường Đại học Y Hà Nội 2. GS.TS. Trương Nam Hải Viện Công nghệ sinh học Hà Nội - 2018 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này tôi đã nhận được sự hỗ trợ, tạo điều kiện của rất nhiều người đã thông cảm, sẻ chia, động viên và giúp đỡ tôi. Tôi xin được trân trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ! Tôi vô cùng biết ơn PGS. TS. Trần Vân Khánh, Phó giám đốc Trung tâm gen và protein, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian qua. Tôi xin được cảm ơn các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Phòng công nghệ gen Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec đã giúp đỡ trong những chặng đường đã qua. Tôi thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của các các đồng nghiệp tại nơi đây tôi đang công tác, đã giúp tôi hoàn thành nhiệm vụ và nghiên cứu này! Bố, mẹ là những người đã mang tôi đến với cuộc sống;chồng và các con của tôi đã luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Tôi xin được chia sẻ thành quả này với bố, mẹ và gia đình tôi. Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng. Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018 Tác giả Lý Thị Thanh Hà ii sLỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018 Tác giả Lý T Lý Thị Thanh Hà hị Thanh Hà iii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4 1.1. Cấu trúc và các dạng phân tử Hemoglobin ................................................ 4 1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường ..................................................... 4 1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin ....................................................................... 5 1.2. Bệnh  thalassemia ...................................................................................... 6 1.2.1. Khái niệm ............................................................................................. 6 1.2.2. Dịch tễ học bệnh  thalassemia ............................................................. 6 1.2.3. Cơ chế bệnh sinh .................................................................................. 6 1.2.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia ................................................. 9 1.2.5. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh  thalassemia ........................................ 10 1.2.6. Chẩn đoán bệnh  thalassemia ............................................................ 10 1.3. Đột biến gen  globin ................................................................................. 11 1.3.1. Cấu trúc gen  globin .......................................................................... 11 1.3.2. Các dạng đột biến trên gen  globin và một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi  globin ............................................................. 13 1.3.3. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình .............................................. 15 1.3.4. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin ...... 16 1.3.5. Phát hiện người lành mang gen bệnh .................................................. 22 1.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................... 23 1.4.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) ............................................. 24 1.4.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) ........................................... 24 1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) ................ 26 1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh  thalassemia tại Việt Nam .......................... 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 28 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 28 iv 2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 28 2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng ............................... 28 2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia ....................................... 28 2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh ......................................................... 29 2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ................................................................ 29 2.4. Trang thiết bị cần thiết .............................................................................. 29 2.4.1. Trang thiết bị ...................................................................................... 29 2.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 29 2.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 32 2.6. Quy trình xác định đột biến gen  globin ................................................. 32 2.6.1. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi ....................... 32 2.6.2. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối .................... 33 2.6.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ........................................ 33 2.6.4. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin .............................. 34 2.6.5. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin............. 36 2.6.6. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 37 2.6.7. Nuôi cấy tế bào ối ............................................................................... 37 2.7. Vấn đề đạo đức .......................................................................................... 38 2.8. Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................... 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40 3.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu ................................................................ 40 3.2. Kết quả xác định đột biến gen β globin .................................................... 40 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA ...................................................................... 40 3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng ......... 48 3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen bệnh  thalassemia. ............................................................................. 67 v 3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia ............................... 81 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................... 88 4.1. Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia ........................ 88 4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR ......................................................... 88 4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ........................................................ 90 4.1.3. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 91 4.2. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen  globin trên nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương .................................. 91 4.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR ............................. 91 4.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương. ............................................................ 92 4.2.3. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt ................................. 93 4.3. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen  globin trên người mang gen  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương ........................................... 97 4.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................. 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ................................................................................... 104 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .................................................... 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 116 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase Chain Reaction, phản ứng đồng trùng hợp C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR, GAP-PCR PCR khoảng cách RT-PCR Reverse transcrip PCR MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification Sequencing Giải trình tự gen Multiplex Phản ứng đa mồi ASO Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo RDB Reserve dot blot, lai ngược RE - PCR Restriction enzyme – PCR, phản ứng PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn Hb Hemoglobin CO2 Carbon dioxide CO Carbon monoxide NO Nirtric oxide O2 Oxygen  Chuỗi alpha β Chuỗi beta γ Chuỗi gamma δ Chuỗi delta vii ε Chuỗi epsilon ζ Chuỗi zeta (2β2) Hemoglobin A (2δ2) Hemoglobin A2 (ζ2ε2) Hemoglobin Gower1 (2ε2) Hemoglobin Gower2 (ζ2γ2) Hemoglobin Porland (2γ2) Hemoglobin F HPFH Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền HPLC Điện di hemogobin bằng sắc ký lỏng cao áp / Người mang gen  kết hợp mang gen  thalassemia /E Người mang gen  kết hợp mang gen HbE RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu HGB (g/dL) Khối lượng hemoglobin (g/dL) HCT (%) Hematocrit (%) MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung bình hồng cầu (pg) MCHC (%) Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu (%) cffDNA Cell free fetal DNA, ADN tự do của thai nhi NIPD Non invasive Prenatal Diagnosis, chẩn đoán trước sinh không xâm lấn viii PGD Pre-implantation genetic diagnosis, chẩn đoán tiền làm tổ IVF In vitro fertilization, thụ tinh ống nghiệm EQA External Quality Assessment, tổ chức ngoại kiểm WHO World Health Organization, tổ chức y tế thế giới TIF Thalassemia International Fondation, Hiệp hội Thalassemia quốc tế BV Nhi TƯ Bệnh Viện Nhi Trung Ương DT-SHPT Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường .......................................... 5 Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia ........................................... 11 Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia .............................................. 16 Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện đột biến gây bệnh  thalassemia. ...................................................................... 17 Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam ......................... 26 Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam....................... 27 Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến trên trên gen β globin .......................................................................... 31 Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin .................................................. 34 Bảng 2.3. Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin .................... 36 Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm ..................................... 40 Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia .......................................................................................... 41 Bảng 3.3. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia theo vị trí đột biến ............................................................ 42 Bảng 3. 4. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia ..................... 43 Bảng 3.5. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin trên đối tượng người mang gen bệnh. ................................................................................... 69 Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT110706 .......................................... 74 Bảng 3.7. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505M .................................... 75 Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT150926. ......................................... 77 x Bảng 3.9. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505F ...................................... 78 Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của 3 gia đình có kiểu gen kết hợp  và  thalassemia. ............. 80 Bảng 3.11. Kết quả số lượng và tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh. ..................... 83 Bảng 3.12. Kết quả tần số và tỷ lệ alen đột biến trong chẩn đoán trước sinh cho thai nhi ................................................................................................ 83 Bảng 3.13. Tần số và tỉ lệ kiểu gen đột biến xuất hiện ở 178 thai nhi .................... 84 Bảng 4.1. Các đột biến gen β globin phổ biến ở một số quần thể trên thế giới. .... 92 xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường ......................................... 4 Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia ........................................... 8 Hình 1.3. Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin .................................... 13 Hình 1.4. Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR ......................................................... 18 Hình 1.5. Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh. .................................... 24 Hình 1.6. Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh ......................... 25 Hình 2.1. Quy trình xác định đột biến gen  globin ........................................... 32 Hình 2.2. Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin ........................... 37 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................... 39 Hình 3.1. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 có đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG) ............................ 45 Hình 3.2. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 phát hiện kiểu gen CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B) ................ 46 Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT081203 với đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B). .... 47 Hình 3.4. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 có đột biến IVS1-1 (G-T) ................................................................... 48 Hình 3.5. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện kiểu gen IVS1-1(G-T) ........................................................................ 49 Hình 3.6. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 có đột biến IVS2-654 (C-T) ............................................................... 49 Hình 3.7. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện kiểu gen IVS2-654(C-T) .................................................................... 50 Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713 với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B) ........ 51 Hình 3.9. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 51 xii Hình 3.10. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 52 Hình 3.11. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 có đột biến CD71/72(+A) ................................................................... 53 Hình 3.12. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện kiểu gen CD71/72(+A) ....................................................................... 54 Hình 3.13. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT130504 với đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) ....................................................... 55 Hình 3.14. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 55 Hình 3.15. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 phát hiện kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 56 Hình 3.16. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 có đột biến IVS1-5 (G-C) ................................................................... 57 Hình 3.17. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 phát hiện kiểu gen IVS1-5 (G-C) ....................................................................... 57 Hình 3.18. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 có đột biến CD41/42(-TCTT) ............................................................. 58 Hình 3.19. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 phát hiện kiểu gen CD41/42(-TCTT) ................................................................. 59 Hình 3.20. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 có đột biến CD95 (+A) ....................................................................... 59 Hình 3.21. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 phát hiện kiểu gen CD95 (+A) ........................................................................... 60 Hình 3.22. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 có đột biến CD41/42(-TCTT) ............................................................. 61 Hình 3.23. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 phát hiện kiểu gen CD41/42(-TCTT) ................................................................. 61 xiii Hình 3.24. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 phát hiện kiểu gen HbE (GAG-AAG)-CD26 ..................................................... 62 Hình 3.25. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT090304 với với đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26 ................................. 63 Hình 3.26. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC .................................................... 64 Hình 3.27. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp