Luận án Nghiên cứu họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu cicer arietinum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU HỌ GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TCP TRONG ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN PHI SINH HỌC Ở CÂY ĐẬU CICER ARIETINUM LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU HỌ GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TCP TRONG ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN PHI SINH HỌC Ở CÂY ĐẬU CICER ARIETINUM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Đăng Khánh 2. TS. Trần Phan Lam Sơn HÀ NỘI - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Đăng Khánh và TS. Trần Phan Lam Sơn. Trong luận án này, các kết quả được thực hiện trung thực, một phần nội dung đã được công bố trong các Tạp chí khoa học quốc tế uy tín và cũng đã nhận được sự đồng ý của tất cả các tác giả trong các bài báo. Các nội dung trong luận văn cũng chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị nào khác. Toàn bộ các trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Trần Duy Cường ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chương trình đào tạo hợp tác quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) và viện nghiên cứu RIKEN Nhật Bản. Trong suốt quá trình học tập và làm việc, mọi người đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Đăng Khánh – Trưởng bộ môn Kỹ Thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp và TS. Trần Phan Lam Sơn, nguyên trưởng Nhóm nghiên cứu về đáp ứng với yếu tố bất lợi – Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN, Nhật Bản. Các thầy đã hướng dẫn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ với những điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu luận án. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thành viên thuộc Nhóm nghiên cứu về đáp ứng với yếu tố bất lợi của TS Trần Phan Lam Sơn. Mọi người đã hướng dẫn chi tiết và tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành được công trình nghiên cứu này. Hơn nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Đào tạo Sau đại học – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và lãnh đạo viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi để có thể hoàn thành tốt khoá học và hoàn thiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình tôi, mọi người luôn luôn động viên tôi ngay từ những ngày đầu bắt đầu khoá học cho tới lúc tôi có thể hoàn thành được công trình nghiên cứu và luận án này. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, anh chị em và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập tại Nhật Bản cũng như thời gian hoàn thiện luận án tại Việt Nam. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Trần Duy Cường iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ x DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... xi MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Tổng quan về cây đậu gà ....................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc, và phân bố của cây đậu gà .......................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái cây đậu gà ......................................................... 4 1.1.3. Phân loại đậu gà ............................................................................... 5 1.1.4. Đa dạng di truyền đậu gà ................................................................. 7 1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của cây đậu gà ................................................... 8 1.2. Các nghiên cứu về cây đậu gà .............................................................. 10 1.2.1. Chọn tạo các giống đậu gà mang đặc điểm mong muốn ............... 10 1.2.2. Tình hình sản xuất cây đậu gà ...................................................... 22 1.3. Họ nhân tố phiên mã TCP .................................................................... 24 1.3.1. Nghiên cứu về các nhân tố phiên mã ở thực vật .......................... 24 1.3.2. Họ nhân tố phiên mã TCP ............................................................. 26 1.3.3. Vai trò và chức năng của nhóm phiên mã TCP ............................. 28 1.3.4. Chọn tạo các giống đậu gà chống chịu stress bất thuận dựa trên các nhân tố phiên mã ..................................................................................... 32 iv Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 40 2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 40 2.1.1. Hạt giống đậu gà và Arabidopsis ................................................... 40 2.1.2. Hóa chất và các thiết bị nghiên cứu .............................................. 40 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu nghiên cứu .................................... 41 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 41 2.3.1. Nhận dạng, xác định vị trí nhiễm sắc thể và phân tích các trường hợp sao chép gen của các gen CaTCP trong bộ gen cây đậu gà .............. 42 2.3.2. Xác định đặc tính của các Protein của CaTCPs ............................. 44 2.3.3. Phân tích cấu trúc của gen CaTCP ................................................ 45 2.3.4. Dự đoán các yếu tố điều hoà Cis .................................................. 46 2.3.5. Phân tích hiện tượng lặp gen ở họ gen mã hoá TCP trên đậu gà .. 47 2.3.6. Mức độ biểu hiện của gen mã hoá CaTCP bằng RT-qPCR và phân tích thống kê ............................................................................................ 49 2.3.7. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA, thiết kế mồi sử dụng cho phân tích sự biểu hiện gen TCP ở cây đậu gà ......................................... 50 2.3.8. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen CaTCP07 trong cây mô hình Arabidopsis ...................................................................................... 52 2.3.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen Arabidopsis chứa gen 35S:CaTCP07 ................................................................................... 53 2.3.10. Thu mẫu tách RNA đánh giá mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 trong cây chuyển gen ............................................................................... 55 2.3.11. Đo mức độ rò rỉ ion ..................................................................... 56 2.3.12. Đo nhiệt độ bề mặt lá ................................................................... 56 v 2.3.13. Mức độ biểu hiện của một số gen liên quan đến mã hoá các enzyme chống oxy hoá ............................................................................ 56 2.3.14. Phương pháp phân tích thống kê ................................................. 57 Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 58 3.1. Xác định sự phân bố trên nhiễm sắc thể và sao chép gen của CaTCP 58 3.2. Phân tích cấu trúc của họ gen CaTCP ở cây đậu gà ............................ 61 3.3. Dự đoán các yếu tố điều hoà Cis ......................................................... 65 3.4. Biểu hiện của các gen CaTCP trong các cơ quan khác nhau trong các giai đoạn phát triển ...................................................................................... 66 3.5. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP trong lá và rễ của cây đậu gà trong điều kiện khử nước và xử lý ABA .................................................... 69 3.6. Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá TCP giữa hai giống đậu gà ILC482 và Hashem ..................................................................................... 73 3.6.1. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá và rễ của giống ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý hạn ...................................................... 73 3.6.2. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá và rễ của giống ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA ................................................... 79 3.7. Kết quả thiết kế vector biểu hiện gen CaTCP07 trong cây mô hình Arabidopsis ................................................................................................. 85 3.8. Sàng lọc sơ bộ và lựa chọn các dòng cây Arabidopsis chuyển gen CaTCP07 ..................................................................................................... 87 3.9. Mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 của cây Arabidopsis chuyển gen ..................................................................................................................... 91 vi 3.10. Khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:CaTCP07 so với cây đối chứng WT ................................................................................ 92 3.11. Khả năng bảo toàn tế bào và tốc độ thoát hơi nước bề mặt lá của cây chuyển gen .................................................................................................. 95 3.12. Sự biểu hiện của gen CaTCP07 giúp cây Arabidopsis chuyển gen phản ứng lại quá trình oxy hoá trong điều kiện hạn hán ............................. 96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 99 Kết luận ....................................................................................................... 99 Kiến nghị ..................................................................................................... 99 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................. 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 102 PHỤ LỤC ..................................................................................................... 129 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt ABA Abscisic acid Axit abscisic AFLP Amplified fragment length polymorphism Đa hình chiều dài đoạn khuếch đại AP2/ERF APETALA2/Ethylene response element binding factors Các yếu tố liên kết đáp ứng với ethylene APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase bHLH basic Helix – Loop – Helix Vùng cơ bản Helix-Loop- Helix bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP CAT Catalase Catalaza cDNA complementary DNA ADN bổ sung CDS Coding sequence Trình tự mã hóa CSD1 Copper/Zinc superoxide dismutase 1 Copper/Zinc superoxide dismutase 1 CTDB Chickpea transcriptome database Cơ sở dữ liệu hệ phiên mã cây đậu gà CYC Cycloidea Yếu tố điều hòa trong sự phát triển tính đối xứng của hoa. DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic DREB Dehydration responsive element-binding protein Protein liên kết với yếu tố đáp ứng mất nước ERF Ethylene Responsive Factor Yếu tố phản ứng với Ethylene FB Flower bud stages Giai đoạn nụ hoa FL Flower stages Giai đoạn hoa viii gDNA genomic DNA DNA nhiễm sắc thể GM Germination medium Môi trường nảy mầm GS germinating seedlings Hạt nảy mầm HSP90 heat shock protein 90 Protein sốc nhiệt 90 ITS Internal transcribed spacer Vùng mã hóa đoạn RNA không đóng vai trò chức năng trong vùng mã hóa các RNA ribosome nhân. kDa Kilodalton Đơn vị khối lượng nguyên tử L1/L2 Line1/Line2 Dòng1/dòng2 MAS Marker-assisted selection Chọn giống nhờ chỉ thị phân từ liên kết với tính trạng mục tiêu. mRNA Messenger RNA RNA thông tin mW Molecule Weight Trọng lượng phân tử MYB MYB transcription factor Yếu tố phiên mã MYB NAC NAM (no apical meristem), ATAF1/2, CUC2 (cup-shaped cotyledon) Yếu tố phiên mã NAC NF-Y Nuclear transcription factor-Y Nhân tố phiên mã Y NGS Next-Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới PCF1/2 Proliferating Cell Nuclear Antigen Factor1/2 Nhân tố kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh 1/2 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase qRT-PCR Quantitative real-time PCR PCR định lượng QTL Quantitative trait locus Locus tính trạng số lượng RD29A Responsive to desiccation 29A Đáp ứng với sự mất nước 29A ix RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNA-seq RNA sequencing Phân tích giải trình tự RNA ROS Reactive oxygen species Các loại phản ứng oxi hóa SAM shoot apical meristem Mô phân sinh đỉnh chồi SNP single nucleotide polymorphism Đa hình nucleotide đơn SSR Simple Sequence Repeat Trình tự đơn lặp lại STMS Sequence-tagged microsatellite sites trình tự vùng vi vệ tinh đích TB1 Teosinte Branched1 Gen mục tiêu đặc hiệu chồi bên. TF Transcription factor Yếu tố phiên mã TF TCP Transcription Factor Teosinte Branched1/ Cycloidea/ Proliferating Cell Nuclear Antigen Factor1/2 Transcription Factor Teosinte Branched1/ Cycloidea/ Proliferating Cell Nuclear Antigen Factor1/2 WDS Water Deficit Stress stress thiếu hụt nước WRKY WRKY transcription factor Yếu tố phiên mã WRKY WT Wild-type Loài (cây) gốc, loài nguyên thủy, cây đối chứng không chuyển gen WW Well-watered Tưới nước đầy đủ YL Young leaf Lá non x DANH MỤC BẢNG TT Bảng Nội dung Trang 2.1 Đột biến điểm gây ra sự thay thế đồng nghĩa và không đồng nghĩa 48 2.2 Các cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm được thiết kế bằng phần mềm Primer3 51 3.1 Thông tin chi tiết của các gen CaTCP đã được xác định 60 3.2 Đặc điểm nhận dạng CaTCP 63 3.3 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 76 3.4 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 78 3.5 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 81 3.6 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 83 xi DANH MỤC HÌNH TT Hình Nội dung Trang 1.1 Hoa của hai loại đậu gà Desi và Kabuli 6 1.2 Chiến lược nghiên cứu về khả năng chống chịu hạn, nắng nóng trên cây đậu gà 15 1.3 Thách thức và trọng tâm được đưa ra trong nghiên cứu liên quan đến chuyển gen và chỉnh sửa bộ gen của đậu gà trên toàn thế giới 21 1.4 Tỷ trọng sản lượng đậu gà trung bình hàng năm theo khu vực từ năm 2008 đến năm 2017 24 1.5 Vị trí và cơ chế điều khiển của Transcription factor 26 2.1 Cách tiếp cận để xác định nhóm TF TCP trên đối tượng đậu gà 42 2.2 Cách tiếp cận để xác định nhóm TF TCP trên đối tượng đậu gà (TT) 43 2.3 Mô tả cách tiếp cận công cụ ExPASy-Protparam 44 2.4 Mô tả cách tiếp cận công cụ ExPASy-Protparam (TT) 45 2.5 Mô tả cách tiếp cận công cụ phân tích cấu trúc gen 46 2.6 Mô tả cách tiếp cận công cụ PlantCARE nhằm xác định các yếu tố điều hoà Cis 47 3.1 Xác định vị trí của các gen CaTCP trên nhiễm sắc thể 59 3.2 Phân tích cấu trúc và phát sinh gen của 23 thành viên CaTCP được xác định 62 3.3 Biểu hiện của các gen CaTCP đã được xác định trong các cơ quan khác nhau trong quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu gà trong các điều kiện sinh trưởng bình thường thu được từ Cơ sở dữ liệu phiên mã cây 68 xii đậu gà (CTDB) 3.4 Phân tích biểu hiện các gen CaTCP trong mẫu lá cây đậu gà trong điều kiện mất nước và xử lý ABA bằng cách sử dụng qRT-PCR 71 3.5 Phân tích biểu hiện của các gen CaTCP trong mẫu rễ cây đậu gà trong điều kiện mất nước và xử lý ABA bằng cách sử dụng qRT-PCR 72 3.6 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 75 3.7 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 77 3.8 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 82 3.9 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 84 3.10 Kết quả điện di kiểm tra thiết kế vector pENTR/D- TOPO CaTCP07 87 3.11 Cây sau khi được chuyển cấu trúc 35S:CaTCP07 ở thế hệ T0 88 3.12 Chọn lọc các cây mang gen CaTCP07 89 3.13 Sàng lọc dòng L1, L2 mang cấu trúc 35S:CaTCP07 90 3.14 Mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 trong 2 dòng chuyển gen L1 và L2 91 xiii 3.15 Kiểu hình chịu hạn của cây chuyển gen 35S:CaTCP07 L1 và L2 bằng phương pháp phân tích tỉ lệ cây sống sót sau xử lý hạn 93 3.16 Kiểu hình chịu hạn của cây chuyển gen 35S:CaTCP07 L1, L2 và WT khi sử dụng phương pháp đánh giá mức độ giảm sinh khối trong điều kiện đầy đủ và thiếu hụt nước 94 3.17 So sánh mức độ rò rỉ ion của cây chuyển gen 35S:CaTCP07 L1, L2 và WT dưới điều kiện gây hạn nhân tạo 95 3.18 Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá các enzyme chống oxy hoá trên cây chuyển gen 35S:CaTCP07 L1, L2 và cây đối chứng WT 97 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sự gia tăng dân số hiện nay trên thế giới đang dần vượt quá sự đáp ứng về nguồn lương thực cung cấp đủ để bù đắp cho số lượng người gia tăng. Bên cạnh đó, quá trình biến đổi khí hậu toàn cầu cũng tác động không nhỏ đến năng suất chất lượng lương thực. Trong đó các điều kiện bất lợi như lạnh, hạn hán và ngập mặn là ba trong số các yếu tố chính tác động trực tiếp đến sự phát triển và hạn chế năng suất cây trồng. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, cơ thể thực vật luôn luôn diễn ra các quá trình thay đổi phức tạp khi gặp phải những điều kiện bất lợi. Thực vật đáp ứng với các bất lợi phi sinh học được diễn ra ở các giai đoạn khác nhau dưới sự tác động của một hoặc nhiều yếu tố bất lợi trong cùng một thời điểm. Nghiên cứu và tìm hiểu rõ về các cơ chế phản ứng lại của cây trồng sẽ giúp nâng cao được năng suất cây trồng, vì vậy đây là vấn đề được xem như rất quan trọng và là trọng tâm của các đề tài nghiên cứu khoa học hiện nay. Dưới tác động của các yếu tố ngoại cảnh bất lợi, một loạt các thay đổi về sinh lý, sinh hóa diễn ra bên trong cơ thể thực vật như: sự rò rỉ ion (electrolytic leakage), thay đổi hàm lượng nước (relative water content), kích thích phát triển bộ rễ, và đặc biệt dễ nhận thấy trên cơ thể thực vật đó là sự thay đổi về lá như giảm diện tích lá, héo lá hoặc thậm chí rụng lá. Ngoài ra, các điều kiện bất lợi còn làm tăng sự tích lũy các gốc tự do phá vỡ sự cân bằng nội mô tế bào bằng cách phản ứng với protein, lipid và các axit nucleic dẫn đến oxi hóa lipid, gây tổn thương tế bào và làm bất hoạt enzyme, làm ảnh hưởng đến các hoạt động của tế bào. Các phản ứng xảy ra bên trong cơ thể thực vật với các yếu tố tác động bất lợi phi sinh học đó là nhận diện yếu tố bất lợi, ngay sau đó tín hiệu được truyền đến các thành phần tiếp nhận, qua đó 2 kích hoạt chức năng gene biểu hiện và kích thích các nhân tố phiên mã (TFs), sau cùng dẫn tới những thay đổi về trao đổi chất của thực vật để chống chịu với các điều kiện bất lợi tác động. Hiện nay, một số nhóm nhân tố phiên mã đã được nghiên cứu có liên quan đến khả năng chịu hạn của cây trồng. Trong đó, nhóm nhân tố phiên mã TCP cũng đã được chứng minh có liên