Tương tự, dung dịch 2 hợp chất thương mại FDME và DEHP ở nồng độ 1% và 2% (Wlá tươi/Vnước cất) được pha chế như Bảng 3.9. Mỗi hợp chất ở các nồng độ tương ứng được lọc bằng đầu lọc vi khuẩn với giấy lọc Ø = 0,2 μm trong điều kiện vô trùng. Kết quả, thu được dung dịch hợp chất ở nồng độ tương ứng trong điều kiện vô trùng và được sử dụng để khảo sát ức chế vi khuẩn Xoo ngay sau đó.
Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Xoo 109 CFU/mL dùng để khảo sát ức chế trên địa thạch được chuẩn bị như sau: dùng que cấy vô trùng lấy đầy 2 loop vi khuẩn đã phát triển trên môi trường Wakimoto từ 48 giờ cho vào 10 mL nước cất đã thanh trùng. Huyền phù vi khuẩn được đo quang phổ ở bước sóng 600 nm và hiệu chỉnh về giá trị hấp thụ quang phổ về 0,37 (Khoa, 2005; Khoa et al., 2017). Huyền phù vi khuẩn này được sử dụng ngay sau đó.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách trải đều 50 μl huyền phù Xoo mật số 109 CFU/ml lên đĩa petri chứa môi trường Wakimoto bằng que tam giác. Sau đó, đục 5 lỗ đường kính 6 mm trên đĩa thạch để tạo thành 5 giếng. Bố trí các giếng trên mỗi đĩa thạch như sau: Giếng 1, 2 và 3: mỗi giếng 20 μl cao tổng hoặc cao phân đoạn hoặc hợp chất ở nồng độ 1% hoặc 2%. Giếng 4: đối chứng âm, 20 μl nước cất thanh trùng. Giếng 5: đối chứng dương, 20 μl dung dịch CuSO4 1 M.
Sau đó đĩa thạch được giữ ở điều kiện nhiệt độ phòng (28 ± 1oC). Sau 72 giờ quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn tạo ra bởi các nghiệm thức do sự ức chế trực tiếp sự phát triển của vi khuẩn Xoo.
208 trang |
Chia sẻ: Tuệ An 21 | Ngày: 08/11/2024 | Lượt xem: 35 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại đồng bằng sông Cửu Long, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TRƯƠNG VĂN XẠ
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG VÀ CƠ CHẾ
KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA
CỦA HỢP CHẤT TRONG CÁC LOÀI THỰC VẬT
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ 9420201
Năm 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TRƯƠNG VĂN XẠ
MÃ SỐ NCS: P0920002
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG VÀ CƠ CHẾ
KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA
CỦA HỢP CHẤT TRONG CÁC LOÀI THỰC VẬT
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ 9420201
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN ĐẮC KHOA
TS. NGUYỄN ĐỨC ĐỘ
Năm 2024
CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Luận án này với tựa đề là “Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng
bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long”
do nghiên cứu sinh Trương Văn Xạ thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn
Đắc Khoa và TS. Nguyễn Đức Độ. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận
án tiến sĩ thông qua ngày: // Luận án đã được chỉnh sửa theo góp
ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại.
Thư ký
(ký tên)
Ủy viên
(ký tên)
Ủy viên
(ký tên)
Phản biện 3
(ký tên)
Phản biện 2
(ký tên)
Phản biện 1
(ký tên)
Người hướng dẫn
(ký tên)
Chủ tịch Hội đồng
(ký tên)
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận án, em đã nhận được sự giúp đỡ và hỗ trợ
của nhiều tổ chức và cá nhân. Qua đây, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám
hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm,
Ban Chủ nhiệm Khoa Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập
và hoàn thành luận án.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Nguyễn Đắc Khoa đã truyền đạt
những kiến thức, kinh nghiệm, giúp đỡ, động viên cho em trong suốt thời gian học tập và
thực hiện luận án.
Em xin gửi lời cám ơn đến thầy TS. Nguyễn Đức Độ đã tận tình hướng dẫn em những
nội dung nghiên cứu về trích ly các hợp chất thực vật trong luận án.
Em xin gửi lời cám ơn đến quý thầy cô đã tham gia Hội đồng đề cương, Hội đồng
chuyên đề và tiểu luận tổng quan, Hội đồng báo cáo giữa kỳ, Hội đồng seminar toàn luận
án, Hội đồng báo cáo luận án cấp cơ sở, Quý nhà khoa học Phản biện độc lập có những
đóng góp quý báu giúp em chỉnh sửa và hoàn thiện luận án tốt hơn.
Xin gửi lời cám ơn đến các bạn, các em trong nhóm nghiên cứu Bệnh hại Thực vật
và phòng thí nghiệm Sinh hóa ứng dụng của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã
hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình tôi thực hiện luận án.
Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn ủng hộ
và giúp đỡ để cho tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh và luận án này.
Xin trân trọng cám ơn.
Nghiên cứu sinh
Trương Văn Xạ
i
TÓM TẮT
Cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) là bệnh quan trọng trên ruộng lúa.
Luận án này khảo sát khả năng giúp giảm bệnh và cơ chế kích kháng của các hợp chất
có trong dịch trích các loài thực vật bản địa tại Đồng bằng Sông Cửu Long, nhằm hình
thành biện pháp phòng trị bệnh thân thiện với môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng,
nâng cao năng suất và chất lượng lúa gạo.
Dịch trích cỏ cứt heo, cỏ hôi và sống đời không ảnh hưởng đến khả năng nẩy mầm
và phát triển của hạt lúa và giúp giảm chiều dài vết bệnh tương đương với thuốc hóa học
Starner 20WP. Cây sống đời được xác định là loài Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. dựa
vào đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen ITS. Tất cả vật liệu từ dịch trích lá sống đời
đều không ảnh hưởng đến khả năng nẩy mầm và phát triển của hạt lúa. Trong ba loại
cao tổng lá sống đời được ly trích bằng phương pháp tách chiết lỏng-lỏng, cao tổng
methanol có hiệu quả tương đương với Starner 20WP nên được phân đoạn bằng phương
pháp sắc ký cột silica gel với bốn hệ dung môi khác nhau để tạo ra bốn loại cao phân
đoạn F1, F2, F3 và F4. Cao phân đoạn F3 (dung môi acetone) có hiệu quả tương đương
với Starner 20WP.
Khả năng giúp giảm bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật và cao chiết lá
sống đời có liên quan đến cơ chế kích kháng. Kết quả khảo sát hoạt tính của bốn enzyme
liên quan đến cơ chế kháng bệnh cháy bìa lá gồm peroxidase, catalase, polyphenol
oxidase và phenylalanine ammonia lyase cho thấy hoạt tính của các enzyme tăng cao và
sớm khi hạt giống được ngâm với các loại dịch trích thực vật và cao chiết này.
Sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), bốn hợp chất có khả năng
kích kháng thực vật gồm (i) 5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester,
(ii) linoleic acid, (iii) ethyl linolenate và (iv) 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-
ethylhexyl) ester được phát hiện với tỷ lệ cao (>5%) trong cao tổng methanol và cao
phân đoạn F3. Kết quả khảo sát đối chiếu khả năng giúp giảm bệnh của các sản phẩm
thương mại gồm Dimethyl furan-2,5-dicarboxylate (FDME) [giống cấu trúc (i)],
Linoleic acid-water soluble (LinA) [giống cấu trúc (ii) và (iii)] và Bis(2-ethylhexyl)
phthalate (DEHP) [giống cấu trúc (iv)] cho thấy hỗn hợp FDME và DEHP tỷ lệ 10%:8%
và 10%:10% có khả năng giúp giảm chiều dài vết bệnh tương đương với thuốc Starner
20WP; vì vậy, có thể suy ra hai hợp chất hiện diện trong lá sống đời là 5-
oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester (cấu trúc giống với FDME) và
1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (cấu trúc giống với DEHP) có liên
quan đến cơ chế kích kháng giúp giảm bệnh cháy bìa lá lúa
Từ khóa: cao chiết, Kalanchoe pinnata, kích kháng, Oryza sativa, Xanthomonas
oryzae pv. oryzae
ii
ABSTRACT
Bacterial leaf blight (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) is an important rice disease.
This study aims at testing for disease-reducing effects of bioactive compounds in
extracts of indigenous plants in the Mekong Delta of Vietnam and investigating the
involvement of induced resistance in the observed disease reduction. This helps make
an eco-friendly strategy to control the disease thus improve rice yield and quality.
Aqueous crude extracts of either cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides), cỏ hôi
(Chromolaena odorata) or sống đời (Kalanchoe pinnata) did not show any adverse
effects on rice seed germination and development. Seed soaking using these extracts
reduced lesion lengths on rice leaves similar to application of the bacteriocide Starner
20WP did. Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. used in this study was identified based on
its morphological characteristics and the ITS gene sequence. All extracts made from K.
pinnata leaves using different extraction methods did not show any adverse effects on
rice seed germination and development. Among the three leaf extracts made by the
liquid-liquid extraction method using three different solvents, methanol extract reduced
lesion lengths similar to Starner 20WP did. Four fractionated extracts F1, F2, F3 and F4
were obtained when the methanol extract was fractionated by silica gel column
chromatography using four different solvents. The F3 extract (fractionated in acetone
solvent) reduced lesion lengths similar to Starner 20WP did. Induced resistance involves
in the observed disease reduction. Indeed, activities of the four defense-related and/or
antioxidant enzymes, i.e., peroxidase, catalase, polyphenol oxidase and phenylalanine
ammonia lyase, increased early in rice leaves after seed soaking application with the
extracts.
Using Gas Chromatography Mass Spectrometry, the four bioactive compounds
including (i) 5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester, (ii) linoleic
acid, (iii) ethyl linolenate and (iv) 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester
were detected with high proportions in both methanol and F3 extracts (>5%). The
commercially available chemicals having similar structures with these compounds were
used to have sufficient materials for validation studies. They include Dimethyl furan-
2,5-dicarboxylate (FDME) [equivalent of (i)], Linoleic acid-water soluble (LinA)
[equiv. (ii) and (iii)] and Bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) [equiv. (iv)]. Seed soaking
using the mixture of FDME and DEHP either 10%:8% or 10%:10% provided similar
protection against rice bacterial leaf blight as that of the chemical control. Therefore, the
two bioactive compounds 5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester
(equiv. FDME) and 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (equiv.
DEHP) detected in K. pinnata leaf extracts are attributed to induce rice resistance against
bacterial leaf blight.
Keywords: induced resistance, Kalanchoe pinnata, Oryza sativa, plant extract,
Xanthomonas oryzae pv. oryzae
iii
iv
MỤC LỤC
TÓM TẮT ................................................................................................................ i
ABSTRACT ............................................................................................................ ii
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. iii
MỤC LỤC .............................................................................................................. iv
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. ix
DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. xiv
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ................................................................................... 1
1. 1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ............................................................................................................... 3
1.2.1 Mục tiêu chung ............................................................................................. 3
1.2.2 Mục tiêu cụ thể ............................................................................................. 3
1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 3
1.4 Ý nghĩa của nghiên cứu ....................................................................................... 4
1.4.1 Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 4
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 4
1.5 Tính mới của luận án ........................................................................................... 5
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 6
2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa ............................................................................................ 6
2.1.1 Lược sử bệnh ................................................................................................ 6
2.1.2 Triệu chứng bệnh ......................................................................................... 9
2.1.3 Mầm bệnh ................................................................................................... 10
2.1.4 Quy luật phát sinh bệnh.............................................................................. 10
2.1.5 Biện pháp phòng trừ bệnh .......................................................................... 11
2.2 Tính kháng bệnh của cây trồng ......................................................................... 12
2.2.1 Khái niệm tính kháng bệnh của cây trồng .................................................. 12
2.2.2 Kích thích tính kháng bệnh của cây trồng .................................................. 13
2.3 Các nghiên cứu về cơ chế kích kháng trên cây trồng ........................................ 15
Trang
v
2.3.1 Cơ chế kích kháng của cây trồng thông qua các rào cản vật lý ................. 15
2.3.2 Cơ chế kích kháng của cây trồng thông qua các phản ứng sinh hóa ......... 16
2.3.2.1 Enzyme peroxidase .......................................................................... 17
2.3.2.2 Enzyme catalase .............................................................................. 18
2.3.2.3 Enzyme polyphenol oxidase ............................................................ 19
2.3.2.4 Enzyme phenylalanine ammonia lyase ........................................... 20
2.4 Các hợp chất sinh học trong thực vật ................................................................ 20
2.4.1 Nhóm hợp chất phenolic ............................................................................ 22
2.4.2 Nhóm hợp chất flavonoid ........................................................................... 23
2.4.3 Nhóm hợp chất coumarine ......................................................................... 24
2.5 Phương pháp chiết xuất các hợp chất sinh học.................................................. 25
2.5.1 Tổng quan phương pháp chiết xuất ............................................................ 25
2.5.2 Các phương pháp chiết xuất hợp chất sinh học ......................................... 26
2.5.3 Các phương pháp sắc ký xác định các hợp chất sinh học .......................... 27
2.5.4 Các nghiên cứu xác định hợp chất sinh học bằng phương pháp GC-MS .. 29
2.6 Các loại thực vật sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 30
2.6.1 Cà độc dược................................................................................................ 30
2.6.2 Cỏ cứt heo .................................................................................................. 31
2.6.3 Cỏ hôi ......................................................................................................... 31
2.6.4 Cỏ mực ....................................................................................................... 32
2.6.5 Đậu biếc ..................................................................................................... 33
2.6.6 Diếp cá ....................................................................................................... 34
2.6.7 Diệp hạ châu ............................................................................................... 35
2.6.8 Húng quế .................................................................................................... 36
2.6.9 Lá lốt .......................................................................................................... 37
2.6.10 Sống đời ................................................................................................... 37
2.6.11 Húng chanh .............................................................................................. 38
2.6.12 Thù lù cạnh ............................................................................................... 39
2.6.13 Ngãi cứu ................................................................................................... 40
2.6.14 Tía tô ........................................................................................................ 41
vi
2.6.15 Trầu không ............................................................................................... 41
2.7 Các nghiên cứu kích kháng bệnh cháy bìa lá .................................................... 42
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 44
3.1 Phương tiện ........................................................................................................ 44
3.1.1 Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................... 44
3.1.2 Nguyên vật liệu .......................................................................................... 44
3.1.3 Hóa chất ..................................................................................................... 45
3.2 Phương pháp ...................................................................................................... 46
3.2.1 Tuyển chọn dịch trích thực vật ................................................................... 46
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các loại
dịch trích thực vật ....................................................................................... 46
3.2.3 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật 47
3.2.4 Xác định cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực
vật ............................................................................................................... 47
3.2.4.1 Khảo sát hoạt tính enzyme peroxidase ............................................ 49
3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme catalase ................................................. 49
3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme polyphenol oxidase .............................. 49
3.2.4.4 Khảo sát hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia lyase .............. 50
3.2.5 Đánh giá hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của dịch trích sống đời ............. 50
3.2.6 Xác định loài của cây sống đời sử dụng trong nghiên cứu ........................ 50
3.2.6.1 Ly trích và tinh sạch DNA cây sống đời ......................................... 51
3.2.6.2 Thực hiện phản ứng PCR và điện di ............................................... 51
3.2.6.3 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA .............................. 51
3.2.7 Điều chế cao tổng sống đời bằng các dung môi hữu cơ ............................ 52
3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các loại
cao tổng sống đời ........................................................................................ 53
2.2.9 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá của các loại cao tổng sống đời 53
2.2.10 Xác định cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của cao tổng sống đời ...... 54
3.2.11 Đánh giá hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của cao tổng sống đời trích ly
bằng dung môi methanol ............................................................................ 54
3.2.12 Điều chế cao phân đoạn từ cao tổng sống đời trích ly bằng dung môi
methanol ..................................................................................................... 55
vii
3.2.13 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các cao
phân đoạn.................................................................................................... 56
2.2.14 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá lúa của các loại cao phân đoạn57
2.2.15 Xác định cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của cao phân đoạn ........... 57
3.2.16 Đánh giá hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của cao phân đoạn F3 ............ 58
2.2.17 Xác định các hợp chất trong sống đời có khả năng kích kháng bệnh cháy
bìa lá lúa ..................................................................................................... 58
2.2.18 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các hợp
chất thương mại thay thế cho hợp chất sinh học ly trích từ lá sống đời ..... 59
2.2.19 Khảo sát khả năng và hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của hỗn hợp 2 hợp
chất thương mại FDME và DEHP.............................................................. 61
3.2.20 Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch 61
3.2.21 Xử lý số liệu ............................................................................................. 62
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 63
4.1 Tuyển chọn dịch trích thực vật .......................................................................... 63
4.2 Ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các lo