Luận án Nghiên cứu một số cơ sở khoa học nhằm bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững một số loài trong chi kim tuyến ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN XUÂN BÌNH MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus Blume) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN XUÂN BÌNH MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus Blume) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Thực vật Mã số : 9 42 01 11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Minh Hợi TS. Phạm Hƣơng Sơn HÀ NỘI - 2019 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt CTPT KBTTN KLPT LSNG VQG v/v Tiếng Anh : Công thức phân tử : Khu bảo tồn thiên nhiên : Khối lượng phân tử : Lâm sản ngoài gỗ : Vườn Quốc gia : Tỉ lệ thể tích BAP DEPT FAO HY IBA IUCN Knud LED MS NAA NMR TDZ TLC VW WHO WWF : 6- Benzylaminopurine : Distortionless enhancement by polarization transfer : Food and Agriculture Organization of the United Nations : Hypronex : Indol butyric acid : International Union for Conservation of Nature : Knudson : Light Emitting Diode (Điốt phát quang) : Murashige & Skoog : α- Naphthaleneacetic Acid : Nuclear Magnetic Resonance : Thidiazuron : Thin layer chromatography : Vacin& Went : World Health Organization : World Wide Fund For Nature LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được cảm ơn tới sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của hai thầy hướng dẫn khoa học PGS. TS. Trần Minh Hợi - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Phạm Hương Sơn - Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học & Công nghệ. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Ban lãnh đạo, phòng đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể học tập nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình và những ý kiến đóng góp của PGS. TS. Nguyễn Tiến Đạt, TS. Dương Đức Huyến, cùng sự động viên giúp đỡ tận tình của toàn thể cán bộ Trung tâm Sinh học Thực nghiệm- Viện Ứng dụng Công nghệ, phòng Hoạt chất Sinh học – Viện Hoá sinh biển, phòng Tài nguyên Thực vật – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến cácVQG, KBTTN và các địa phương đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện những nghiên cứu khảo sát điều tra và thu thập mẫu vật. Tôi cũng xin cảm ơn nhiệm vụ bảo tồn và phát triển nguồn gen “Khai thác và phát triển nguồn gen Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) và Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris L.) làm nguyên liệu sản xuất thuốc, đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản mã số 106 – NN. 99- 2013. 41 cùng toàn thể các nhà khoa học thuộc nhiệm vụ và đề tài nói trên đã hỗ trợ kinh phí, cung cấp mẫu vật giúp tôi hoàn thành luận án. Sau cùng không thể không nhắc tới, đó là sự động viên khích lệ cùng sự giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp tôi có thêm nghị lực để hoàn thành đề tài luận án này. Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ trên. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Phan Xuân Bình Minh LƠI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào. Các số liệu tham khảo có trích dẫn nguồn rõ ràng. Nghiên cứu sinh Phan Xuân Bình Minh MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 15 1. Tính cấp thiết của đề tài luận án ....................................................................... 15 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài luận án ........................................................... 16 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án ........................................... 16 4. Những điểm mới của luận án ............................................................................ 16 5. Bố cục của luận án .............................................................................................. 17 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................ 18 1.1. Khái quát về chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) ............................... 18 1.1.1.Vị trí phân loại của chi Kim tuyến .............................................................. 18 1.1.2. Điều kiện sống và vùng phân bố ................................................................ 21 1.1.3. Giá trị của chi Kim tuyến: .......................................................................... 22 1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) trên thế giới ........................................................................................................................ 24 1.2.1. Đa dạng loài ................................................................................................ 24 1.2.2. Thành phần hoạt chất và giá trị dược liệu của chi Kim tuyến ............... 27 1.2.3. Nhân giống, nuôi trồng và bảo tồn các loài thuộc chi Kim tuyến ........ 33 1.3. Tình hình nghiên cứu về chi Kim tuyến ở Việt Nam .................................. 40 1.3.1. Đa dạng loài ................................................................................................ 40 1.3.2. Giá trị dược liệu ........................................................................................... 42 1.3.3. Tình hình nhân giống nuôi trồng và bảo tồn ở Việt Nam ........................ 43 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................................................ 46 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 46 2.1.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................. 46 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 46 2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 47 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 48 2.3.1. Phương pháp thu thập số liệu ngoài thực địa........................................... 48 2.3.1.1. Điều tra thực địa và thu thập mẫu vật .................................................... 48 2.3.1.2. Phương pháp phỏng vấn người cung cấp thông tin quan trọng ......... 48 2.3.1.3. Phương pháp đánh giá nhanh nông thôn (PRA) ................................... 48 2.3.2. Phương pháp phân loại và giám định tên loài ......................................... 48 2.3.3. Phương pháp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học .................... 48 2.3.3.1. Phương pháp chiết tổng ........................................................................... 48 2.3.3.2. Phương pháp phân lập ............................................................................. 49 2.3.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................... 51 2.3.4. Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy in vitro ..................................... 51 2.3.4.1. Phương pháp nhân giống in vitro từ chồi .............................................. 51 2.3.4.2. Phương pháp nhân giống in vitro từ hạt ................................................ 52 2.3.4.3. Phương pháp lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp. ......................... 52 2.3.4.4. Phương pháp xử lý và thống kê số liệu .................................................. 53 2.3.5. Phương pháp nuôi trồng ex vitro ............................................................... 53 2.3.5.1. Phương pháp nuôi trồng trong nhà lưới ................................................ 53 2.3.5.2. Phương pháp nuôi trồng dưới tán rừng ................................................. 53 2.3.5.3. Phương pháp xử lý và thống kê số liệu .................................................. 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................... 55 3.1. Đặc điểm hình thái, phân bố của chi Kim tuyến ở Việt Nam ................... 55 3.1.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 55 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái của Kim tuyến trung bộ (A. annamensis Aver.) .. 57 3.1.1.2. Hình thái của Kim tuyến đá vôi (A. calcareus Aver.) .......................... 59 3.1.1.3. Đặc điểm hình thái của Giải thuỷ tím (Anoectochilus. elwesii C.B. Clarke ex Hook.) ..................................................................................................... 62 3.1.1.4. Đặc điểm hình thái của Lan sứa (A. lylei Rolfe ex Downie.) ............. 64 3.1.1.5 . Đặc điểm hình thái của Kim tuyến tơ (A. setaceus Blume) ................ 68 3.1.2. Khảo sát phân bố của 5 loài thuộc chi Kim tuyến ................................... 71 3.1.2.1. Phân bố của Kim tuyến trung bộ (A. annamensis Aver.) .................... 73 3.1.2.2. Phân bố của Kim tuyến đá vôi (A. calcareus Aver.) ............................ 74 3.1.2.3. Phân bố của Giải thuỳ tím (A. elwesii C.B. Clarke ex Hook.) ............ 74 3.1.2.4. Phân bố của Kim tuyến lyle (A. lylei Rolfe ex Downie) ...................... 74 3.1.2.5. Phân bố của Kim tuyến tơ (A. setaceus Blume) .................................... 75 3.2. Thành phần hoá học của hai loài Kim tuyến (A. setaceus Blume và A. annamensis Aver.) .................................................................................................. 77 3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất trong Kim tuyến tơ ( A. setaceus) ............................................................................................ 78 3.2.1.1. Phân lập các hợp chất .............................................................................. 78 3.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các chất trong cây Kim tuyến trung bộ ( A. annamesis)............................................................................. 89 3.2.2.1. Các hợp chất được phân lập.................................................................... 89 3.2.2.2. Cấu trúc các hợp chất .............................................................................. 91 3.3. Hiện trạng khai thác, sử dụng và buôn bán các loài thuộc chi Kim tuyến ...... 99 3.3.1. Hiện trạng khai thác .................................................................................. 100 3.3.2. Hiện trạng sử dụng và buôn bán và quản lý các loài Kim tuyến tại địa phương ..................................................................................................... 103 3.4. Giải pháp bảo tồn và phát triển các loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) ......................................................................................... 106 3.4.1. Giải pháp nhân giống và nuôi trồng ba loài Kim tuyến (Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle) ............................................................... 106 3.4.1.1. Giải pháp nhân giống ba loài Kim tuyến Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle bằng phương pháp nuôi cấy in vitro .................... 107 3.4. 1.2. Giải pháp nuôi trồng Kim tuyến .......................................................... 133 3.4.2. Giải pháp quản lý và tuyên truyền ....................................................... 143 3.4.2.1. Giải pháp quản lý ................................................................................. 143 3.4.2.2. Giải pháp tuyên truyền ........................................................................ 144 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...................................................................................... 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 149 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hiện trạng phân bố của 5 loài trong chi Kim tuyến( Anoectochilus Blume) ................ 72 Bảng 3.2: Danh sách các chất phân lập từ Kim tuyên tơ (A. setaceus) ............................ 87 Bảng 3.3: Danh sách các chất phân lập được từ Kim tuyến trung bộ .............................. 97 Bảng 3.4: Sản lượng khai thác và thu mua Kim tuyến tại 16 điểm khảo sát ................... 101 Bảng 3.5: Tỷ lệ các hộ khai thác và sử dụng các loài thuộc chi Kim tuyến .................... 103 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng sinh mầm của Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle sau 4 tuần ....................................................... 107 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ đến giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu của hai loài Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle sau 4 tuần nuôi cấy. ......................... 109 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của môi trường khoáng và chất kích đến khả năng nảy mầm của hạt Kim tuyến trung bộ nuôi cấy in vitro .......................................................................... 111 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của môi trường khoáng và nồng độ BAP đến khả năng nảy mầm của hạt Kim tuyến lyle khi nuôi cấy in vitro ...................................................................... 113 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của môi trường khoáng và nồng độ BAP đến khả năng nảy mầm của hạt Kim tuyến tơ khi nuôi cây in vitro ................................................................... 115 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến giai đoạn nhân nhanh của hai loài Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle sau 8 tuần nuôi cấy ............... 118 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh nhân nhanh trưởng 3 loài Kim tuyến Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................................................... 121 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của mầm Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ sau 8 tuần nuôi cấy. .................... 124 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của NAA; IBA đền Kim tuyến trung bộ ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy ........................................................................................... 128 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của NAA; IBA đền Kim tuyến lyle ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy .................................................................................................... 129 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình ra rễ của ba loài Kim tuyến (Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ) sau 6 tuần nuôi cấy .................. 131 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ sau 16 tuần nuôi trồng ................................. 134 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của mùa vụ trồng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Kim tuyến tơ sau 16 tuần nuôi trồng ngoài tự nhiên ............................................................ 136 Bảng 3.19: Mức độ gây hại của các loại sâu bệnh hại chính trên cây Kim tuyến tơ (03/2014- 2/2015) ...................................................................................................... 139 Bảng 3.20: Đề xuất các địa điểm bảo tồn các loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) .................................................................................................................... 130 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Anoectochilus koshunensis: a. Hoa; b. Cây mọc trong tự nhiên ................... 21 Hình 1.2: Anoectochilus zhejiangensis: a. Cây mọc trong tự nhiên; b. Hoa ..................... 21 Hình 1.3: Anoectochilus trong tự nhiên ........................................................................... 22 Hình 1.4: Một số sản phẩm từ A. formosanus ................................................................ 33 Hình 1.5: Mô hình nhân giống và nuôi trồng A. formosanus tại Đài Loan ....................... 38 Hình 1.6: Một số sản phẩm từ Kim tuyến của Việt Nam ................................................ 43 Hình 3.1: Hình ảnh mô tả phác hoạ chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) ............ 56 Hình 3.2 : Hình thái Kim tuyến trung bộ (A. annamensis Aver.) ..................................... 58 Hình 3.3 : Kim tuyến trung bộ A. annamensis Aver.- .............................................. 59 Hình 3.4 : Hình thái Kim tuyến đá vôi (A. calcareus Aver. ) .......................................... 61 Hình 3.5 : Kim tuyến đá vôi Anoectochilus calcareus Aver. ................................... 62 Hình 3.6: Hình thái Giải thuỳ tím (A. elwesii C.B. Clarke ex Hook.) ............................... 64 Hình 3.7: Anoectochilus elwesii C.B. Clarke ex Hook.- Hình thái Giải thuỳ tím .... 64 Hình 3.8 : Hình thái Kim tuyến lyle (A. lylei Rolfe ex Downie) ...................................... 67 Hình 3.9: Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie. - Kim tuyến lyle ......................... 68 Hình 3.10: Hình thái Kim tuyến tơ (A . setaceus Blume ) .............................................. 70 Hình 3.11: Kim tuyến tơ (Anoectochilus setaceus Blume) ....................................... 71 Hình 3.12 : Các loài Kim tuyến mọc ngoài tự nhiên: ...................................................... 76 Hình 3.13: Sơ đồ phân bố năm loài thuộc chi Kim tuyến ................................................ 77 Hình 3.14: Cấu trúc hợp chất ARE3.5 ..................................................................... 80 Hình 3.15: Cấu trúc hợp chất ARW10.1 ................................................................... 81 Hình 3.16: Cấu trúc hợp chất ARW4.5 ..................................................................... 82 Hình 3.17: Cấu trúc hợp chất ARW11.4 .................................................................. 83 Hình 3.18: Cấu trúc hợp chất ARW5.2 ..................................................................... 84 Hình 3.19. Cấu trúc hợp chất ARW12.2 ................................................................... 85 Hình 3.20: Cấu trúc hợp chất stigmasterol ................................................................ 86 Hình 3.21: Cấu trúc hợp chất benzyl-β-D-glucopyranoside ..................................... 86 Hình 3.22: Cấu trúc hợp chất methylarbutin ............................................................ 87 Hình 3.23: Cấu trúc của hợp chất AAH9.10 ............................................................. 91 Hình 3.24: Cấu trúc của hợp chất AAE14.13 và các tương tác chính HMBC (→),COSY (▬)NOESY ( ) ................................................................................... 92 Hình 3.25a: Phổ 1H NMR của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) ................ 92 Hình 3.25b: Phổ 13C NMR của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 150 MHz) ............... 93 Hình 3.25c: Phổ DEPT của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 150 MHz) .................... 93 Hình 3.25d: Phổ HSQC của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) ................... 94 Hình 2.25e: Phổ HMBC của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) ................... 95 Hình 3.25f: Phổ NO