Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn mycoplasma, klebsiella, escherichia coli phân lập từ bò sữa viêm vú tại trang trại th và biện pháp phòng, trị

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN TRUNG MỸ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN MYCOPLASMA, KLEBSIELLA, ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ BÒ SỮA VIÊM VÚ TẠI TRANG TRẠI TH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG, TRỊ LUẬN ÁN TIẾN SĨ KÝ SINH TRÙNG VÀ VI SINH VẬT HỌC THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2024 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN TRUNG MỸ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN MYCOPLASMA, KLEBSIELLA, ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ BÒ SỮA VIÊM VÚ TẠI TRANG TRẠI TH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG, TRỊ Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học Thú y Mã số: 9. 64. 01. 04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KÝ SINH TRÙNG VÀ VI SINH VẬT HỌC THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2024 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn. Cuối cùng, tôi xin cam đoan rằng tôi đã tuân thủ tất cả các quy định và quy chế của cơ sở đào tạo và các cơ quan quản lý liên quan trong quá trình thực hiện luận án này. Tác giả Trần Trung Mỹ ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đặng Xuân Bình, TS. Đặng Thị Mai Lan đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo của Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau đại học - Đại học Thái Nguyên, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh. Chân thành cảm ơn quý thầy cô và cán bộ công nhân viên khoa Chăn nuôi Thú y đã động viên và hỗ trợ tôi nhiều mặt trong thời gian thực hiện và hoàn thành Luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám đốc Công ty cổ phần thực phẩm sữa TH, Ban Quản lý các trang trại, phòng Thú y và cán bộ công nhân viên phòng Đảm bảo Chất lượng thuộc Công ty cổ phần thực phẩm sữa TH đã tạo điều kiện, hỗ trợ cho tôi thực hiện Luận án. Xin cảm ơn đến tất cả người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành công việc học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án này. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2024 NGHIÊN CỨU SINH iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... ix DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ..................................................................................... x MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................... 2 4. Các điểm mới của đề tài luận án ............................................................................. 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Tổng quan về vi khuẩn M. bovis, Klebsiella và E. coli ....................................... 3 1.1.1. Vi khuẩn M. bovis ............................................................................................. 3 1.1.2. Vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................... 6 1.1.3. Vi khuẩn E. coli ............................................................................................... 13 1.2. Bệnh viêm vú do vi khuẩn M. bovis, Klebsiella và E. coli gây ra trên bò sữa .. 18 1.2.1. Tình hình bệnh viêm vú bò sữa trên thế giới và ở Việt Nam .......................... 18 1.2.2. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh viêm vú do Mycoplasma, Klebsiella, E. coli gây ra ở bò sữa ............................................................................. 20 1.2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm vú bò sữa ......................................... 23 1.3. Biện pháp phòng và trị bệnh viêm vú bò sữa ..................................................... 25 1.3.1. Biện pháp phòng bệnh viêm vú bò sữa ........................................................... 25 1.3.2. Biện pháp điều trị bệnh viêm vú bò sữa .......................................................... 31 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 35 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu..................................................... 35 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 35 iv 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 35 2.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 35 2.2.1. Các loại mẫu dùng trong nghiên cứu .............................................................. 35 2.2.2. Các loại môi trường, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu .... 35 2.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 36 2.3.1. Tình hình bệnh viêm vú bò sữa tại các trang trại TH ........................................... 36 2.3.2. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Mycoplasma, Klebsiella và E. coli phân lập từ bò sữa viêm vú ....................................................................................... 36 2.3.3. Nghiên cứu và đề xuất biện pháp phòng, trị bệnh viêm vú cho bò sữa ................. 36 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 36 2.4.1. Phương pháp phát hiện tình hình bệnh viêm vú bò sữa tại các trang trại TH ..... 36 2.4.2. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Mycoplasma, Klebsiella và E. coli ............................................................................ 38 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu và đề xuất biện pháp phòng, trị bệnh viêm vú cho bò sữa .................................................................................................................. 48 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 53 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 54 3.1. Tình hình bệnh viêm vú bò sữa tại các trang trại TH ............................................. 54 3.1.1. Tỷ lệ bệnh viêm vú bò sữa tại TH ................................................................... 54 3.1.2. Tần suất mắc bệnh viêm vú bò sữa tại các trang trại TH ................................ 55 3.1.3. Tình hình bò sữa mắc viêm vú theo thể bệnh ................................................. 56 3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn M. bovis, Klebsiella và E. coli phân lập từ bò sữa viêm vú tại các trang trại TH........................................... 57 3.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn M. bovis ...................................................... 57 3.2.2. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Klebsiella gây bệnh viêm vú bò sữa ........................................................................................................................ 68 3.2.3. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn E. coli gây bệnh viêm vú bò sữa ..... 84 3.3. Nghiên cứu và đề xuất biện pháp phòng trị bệnh viêm vú cho bò sữa .............. 98 3.3.1. Nghiên cứu một số biện pháp phòng bệnh viêm vú cho bò sữa ..................... 98 v 3.3.2. Đánh giá hiệu quả của một số phác đồ điều trị bệnh viêm vú ở bò sữa do Klebsiella và E. coli gây ra ..................................................................................... 106 3.3.3. Biện pháp tổng hợp phòng, trị bệnh viêm vú ở bò sữa ................................. 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN ............................................................................................................... 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 117 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 149 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Nghĩa tiếng Việt ACTC American Type Culture Collection Bộ chủng giống chuẩn Mỹ ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic bp Base-pair Cặp ba-zơ CLSI Clinical and Laboratory Standards Viện tiêu chuẩn lâm sàng và Institute phòng thí nghiệm CMT California mastitis test Phương pháp thử CMT CPS Capsular polysaccharide Kháng nguyên K cs - Cộng sự ESBL Extended-Spectrum Beta- Men phân giải kháng sinh Beta- Lactamase Lactam phổ rộng HMV Hypermucoviscous phenotype Kiểu hình khuẩn lạc nhầy LPS Lipopolysaccharide Kháng nguyên O MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu OMP Outer memberance protein Protein màng ngoài PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase ppm Part per million Một phần triệu SCC Somatic cell count Số lượng tế bào thân (sô-ma) TH True happiness Hạnh phúc đích thực vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Klebsiella ................................... 7 Bảng 1.2: Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli ....................................... 14 Bảng 2.1: Diễn giải kết quả thử CMT .................................................................... 37 Bảng 2.2: Phân loại viêm vú theo thể bệnh ............................................................ 37 Bảng 2.3: Các loại kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 45 Bảng 2.4a: Tiêu chí xác định sự sản sinh ESBL ở vi khuẩn .................................... 46 Bảng 2.4b: Bố trí thí nghiệm phòng viêm vú bằng chất độn nền chuồng ................ 49 Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm phòng viêm vú bằng nồng độ hóa chất sát trùng ....... 49 Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm phòng viêm vú bằng vắc xin Rotatec J5 ở bò chuẩn bị cho sữa chu kỳ 1 ...................................................................... 50 Bảng 2.7: Bố trí thí nghiệm phòng viêm vú bằng vắc xin Rotatec J5 ở bò cho sữa chu kỳ 2 ........................................................................................... 50 Bảng 2.8: Bố trí thí nghiệm phòng viêm vú bằng chất bịt núm vú trên bò chuẩn bị cho sữa chu kỳ 1 ...................................................................... 51 Bảng 2.9: Bố trí thí nghiệm phòng viêm vú bằng chất bịt núm vú trên bò cho sữa chu kỳ 2 ........................................................................................... 51 Bảng 2.10: Một số phác đồ điều trị viêm vú lâm sàng do Klebsiella, E. coli .......... 52 Bảng 3.1: Tỷ lệ bệnh viêm vú ở bò sữa tại TH ...................................................... 54 Bảng 3.2: Tần suất mắc bệnh viêm vú bò sữa ........................................................ 55 Bảng 3.3: Tỷ lệ bò mắc viêm vú theo thể bệnh ...................................................... 57 Bảng 3.4: Kết quả phân lập vi khuẩn M. bovis từ bò viêm vú và không viêm vú ....... 58 Bảng 3.5: Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của các chủng M. bovis ............... 59 Bảng 3.6: Kết quả xác định một số chủng vi khuẩn M. bovis bằng kỹ thuật PCR....... 61 Bảng 3.7: Kết quả xác định một số gen độc lực của các chủng vi khuẩn M. bovis .......... 66 Bảng 3.8: Kết quả phân lập vi khuẩn Klebsiella từ bò bị và không bị viêm vú ..... 68 Bảng 3.9: Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Klebsiella ..... 70 Bảng 3.10: Kết quả xác định một số chủng vi khuẩn Klebsiella ............................. 71 Bảng 3.11: Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn Klebsiella .................... 73 Bảng 3.12: Sự đa kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được ........ 76 viii Bảng 3.13: Kết quả xác định khả năng sản sinh men phân giải kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng của một số chủng vi khuẩn Klebsiella ..................... 77 Bảng 3.14: Một số gen kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập ......... 79 Bảng 3.15: Kết quả xác định các gen độc lực của các chủng Klebsiella. ................ 82 Bảng 3.16: Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ bò viêm và không viêm vú .......... 84 Bảng 3.17: Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli ......... 86 Bảng 3.18: Kết quả xác định kết quả giám định sinh hóa một số chủng vi khuẩn E. coli phân lập được ............................................................................. 87 Bảng 3.19: Kết quả thử kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn E. coli ................... 89 Bảng 3.20: Sự đa kháng kháng sinh của các chủng E. coli phân lập được .............. 91 Bảng 3.21: Kết quả xác định khả năng sản sinh men phân giải kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng của vi khuẩn E. coli phân lập được ......................... 92 Bảng 3.22: Một số gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli ............................. 93 Bảng 3.23: Kết quả xác định một số gen độc lực của các chủng E. coli .................. 96 Bảng 3.24: Kết quả thử nghiệm các loại nền chuồng tới tỷ lệ mắc bệnh viêm vú bò sữa ..................................................................................................... 98 Bảng 3.25: Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ TeatX đến tỷ lệ viêm vú ở bò sữa ........................................................................................... 100 Bảng 3.26: Kết quả thử nghiệm phòng bệnh bằng vắc xin Rotatec J5 ở bò cho sữa chu kỳ thứ nhất .............................................................................. 101 Bảng 3.27: Kết quả thử nghiệm phòng bệnh bằng vắc xin Rotatec J5 ở bò cho sữa chu kỳ thứ hai ................................................................................ 102 Bảng 3.28: Kết quả thử nghiệm phòng viêm vú ở bò cho sữa chu kỳ thứ nhất bằng chất bịt núm vú Teatseal ............................................................. 104 Bảng 3.29: Kết quả thử nghiệm phòng viêm vú ở bò cho sữa chu kỳ thứ 2 bằng chất bịt núm vú Teatseal ...................................................................... 104 Bảng 3.30: Tỷ lệ bò có chỉ số SCC trên 300.000 tế bào/ml .................................... 106 Bảng 3.31: Kết quả một số phác đồ điều trị bệnh viêm vú lâm sàng do Klebsiella và E. coli ............................................................................. 107 Bảng 3.32: Kết quả điều trị viêm vú lâm sàng theo thể bệnh ................................. 108 Bảng 3.33: Kết quả phân lập lại vi khuẩn gây bệnh sau điều trị đối với bò bị viêm vú do Klebsiella và E. coli .......................................................... 109 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Mô phỏng quá trình xâm nhập vào tế bào có nhân của Mycoplasma ....... 5 Hình 1.2: Các yếu tố gây bệnh của Klebsiella ..................................................... 8 Hình 1.3: Thí nghiệm kéo sợi (string test) dương tính của K. pneumoniae ...... 10 Hình 1.4: Cấu trúc bề mặt tế bào và các kháng nguyên vi khuẩn Gram âm ..... 15 Hình 2.1: Khuẩn lạc M. bovis trên thạch PPLO ................................................ 39 Hình 2.2: Khuẩn lạc Klebsiella trên thạch MacConkey (A) và thạch máu (B) ..... 40 Hình 2.3: Khuẩn lạc E. coli trên thạch máu ....................................................... 41 Hình 3.1: Kết quả phản ứng sinh hoá của vi khuẩn M. bovis ............................ 60 Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen uvrC (106bp) của vi khuẩn M. bovis ................................................................................... 61 Hình 3.3: Kết quả điện di xác định gen TrmFO (390bp) và Mbov2 (221bp) .... 67 Hình 3.4: Kết quả mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn M. bovis theo phương pháp MIC trên thạch PPLO ................................................................. 62 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen rrs3 (508bp) ............... 65 Hình 3.6: Kết quả một số phản ứng sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................... 71 Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen gyrA (441bp) của vi khuẩn Klebsiella spp. ......................................................................... 72 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen fimH và entB .............. 82 Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen tetA, acrAKp ............... 80 Hình 3.10: Kết quả một số phản ứng sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn E. coli ... 87 Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen malB (585bp) của vi khuẩn E. coli .................................................................................. 88 Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen iutA (302bp), stx2 (118bp), eae (425bp) ......................................................................... 96 Hình 3.13: Kết quả điện di xác định gen tetB và tetA ......................................... 94 Hình 3.14: Đề xuất mô hình quản lý và điều trị bệnh viêm vú do Klebsiella, E. coli, và M. bovis hiệu quả ........................................................... 113 x DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tần suất mắc bệnh viêm vú bò sữa của các trang trại ....................... 56 Biểu đồ 3.2: Kết quả MIC của vi khuẩn M. bovis với một số loại kháng sinh ...... 63 Biểu đồ 3.3: Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Klebsiella phân lập được ................................................................... 74 Biểu đồ 3.4: Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli ..... 90 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây chăn nuôi bò sữa đang dần được dịch chuyển theo hướng thâm canh, an toàn và thân thiện với môi trường. Việc ứng dụng khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi góp phần tăng năng suất lao động, phát triển kinh tế - xã hội tại nhiều địa phương. Sữa và các sản phẩm từ sữa được xếp vào loại thực phẩm cao cấp do đặc tính hoàn chỉnh về dinh dưỡng và dễ tiêu hóa. Từ năm 2009, Tập đoàn TH (TH) bắt đầu xây dựng dự án chăn nuôi bò sữa và chế biến sữa tập trung áp dụng công nghệ cao tại tỉnh Nghệ An. Dự án đã góp phần làm giảm tỷ lệ sử dụng sữa bột để chế biến sữa nước từ 92% vào năm 2008 xuống còn khoảng 60% hiện nay. Hiện nay Việt Nam có số lượng bò khoảng 6.339.400 con (Tổng cục thống kê, 2023). Trong đó, bò sữa chiếm gần 6% với số lượng 375.000 con mang lại doanh thu khoảng 119.385 tỷ đồng trong năm 2022 (Hiệp hội chăn nuôi gia súc lớn Việt Nam, 2023). Bò sữa được quản lý trong 28.000 trang trại hoặc hộ gia đình chăn nuôi. Theo số liệu thống kê năm 2023, tại các trại của TH có khoảng 70.000 con bò, được nuôi tại 8 trang trại nuôi bò sữa lớn trong đó có 1 trang trại nuôi bò theo phương pháp hữu cơ và 1 trang trại cách ly (tân đáo). Chăn nuôi bò nói chung và bò sữa nói riêng vẫn đang đối mặt với không ít khó khăn do các loại bệnh gây hại cho sức khỏe đàn bò, đặc biệt là bệnh viêm vú ở bò sữa. Bệnh viêm vú tuy có tỷ lệ chết không cao nhưng lại gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bò bị bệnh sẽ dẫn tới giảm sản lượng và chất lượng sữa, tăng chi phí điều trị thú y, thất thoát bò và chi phí thay thế đàn. Tại Việt Nam hiện nay chưa có thống kê chi tiết về thiệt hại do bệnh viêm vú bò sữa. Tuy nhiên, ngành chăn nuôi bò sữa tại Mỹ thiệt hại tới tới 2 tỷ đô la mỗi năm do ảnh hưởng từ bệnh viêm vú (Rollin và cs., 2015). Tổn thất cho từng trường hợp viêm vú trung bình khoảng 326 đô la (Liang và cs., 2017). Tại Israel thất thoát ước tính lên tới 1500 lít sữa đối với mỗi trường hợp viêm vú trong chu kỳ sữa 305 ngày (Blum và cs., 2014). Tại các trại chăn nuôi bò sữa TH, bệnh viêm vú hiện đã và đang gây ra các thiệt hại không nhỏ. Đặc biệt, viêm vú do vi khuẩn Mycoplasma, Klebsiella và Escherichia coli (E. coli) đang là vấn đề được các trại hết sức quan tâm do tỷ lệ nhiễm cao và khó 2 điều trị. Xuất phát từ thực tiễn về bệnh viêm vú tại các trại TH, với mục đích cung cấp tài liệu khoa học có liên quan về tình hình bò mắc bệnh viêm vú, một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn Mycoplasma, Klebsiella và E. coli, và công tác phòng và trị bệnh có hiệu quả, chúng tôi tiến hành triển khai đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Mycoplasma, Klebsiella, Escherichia coli phân lập từ bò sữa viêm vú tại trang trại TH và biện pháp phòng, trị”. 2. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá chung về tình hình mắc bệnh viêm vú của bò sữa tại các trại của TH. - Xác định tỷ lệ xuất hiện các loại vi khuẩn Mycoplasma bovis (M. bovis), Klebsiella và E. coli trên bò không bị và bò bị viêm vú. - Xác định một số đặc điểm sinh học của 3 loại vi khuẩn: Mycoplasma bovis (M. bovis), Klebsiella và E. coli được phân lập từ bò sữa viêm vú tại các trang trại TH, huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An. - Đề xuất các biện pháp hiệu quả giúp phòng và điều trị bệnh viêm vú cho bò sữa. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Bổ sung tư liệu khoa học về tình hình mắc bệnh, đặc điểm sinh học của vi khuẩn M. bovis, Klebsiella spp. và E. coli trong chăn nuôi bò sữa. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở thực tiễn về bệnh, và áp dụng các biện pháp phòng trị hiệu quả bệnh viêm vú bò sữa do vi khuẩn M. bovis, Klebsiella spp. và E. coli tại Trang trại TH, huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An. 4. Các điểm mới của đề tài luận án - Xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh viêm vú bò sữa tại TH, tần suất và tình hình mắc bệnh viêm vú theo các thể bệnh khác nhau. - Lần đầu tiên báo cáo về vi khuẩn M. bovis gây viêm vú bò sữa tại Việt Nam. - Xác định được tỷ lệ lưu hành, giám định sinh hóa, xác định bằng sinh học phân tử, đặc tính kháng kháng sinh, một số gen độc lực và kháng kháng sinh của vi khuẩn M. bovis, Klebsiella và E. coli gây viêm vú bò sữa tại TH. - Đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của một số phương pháp mới tại Việt Nam. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi khuẩn M. bovis, Klebsiella và E. coli 1.1.1. Vi khuẩn M. bovis 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo và nuôi cấy Vi khuẩn Mycoplasma có cấu trúc màng tế bào gồm 3 lớp nhưng không có cấu trúc thành tế bào. Bộ gen của vi khuẩn này có kích thước nhỏ từ 580 tới 1380kb. Trong đó, bộ gen của chủng M. bovis có kích thước 1080kb với tỷ lệ G+C thấp (27,8 - 32,8% khối lượng phân tử). Vi khuẩn M. bovis có chiều rộng dao động từ 0,2 đến 0,3µm, và khó có thể quan sát thấy dưới kính hiển vi quang học thông thường (Caswell và Archambault, 2007). Mycoplasma thường được nuôi cấy trên các môi trường chuyên biệt để phát hiện và định danh. Do đặc điểm cấu trúc đơn giản nên vi khuẩn Mycoplasma không có khả năng tổng hợp axit amin và đa số không tổng hợp được các axit béo. Do đó, để đáp ứng yêu cầu cho sự sinh trưởng thì môi trường nuôi cấy vi khuẩn phải đặc hiệu và chứa nhiều dinh dưỡng như: dịch chiết tim bò, huyết thanh, cao nấm men, peptone và các chất bổ sung khác. pH của môi trường ở trong khoảng 7,3-7,8 (Alysia và cs., 2018). Để hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn khác có trong mẫu gây ảnh hưởng tới việc phân lập vi khuẩn Mycoplasma cần bổ sung các chất kháng khuẩn như thalium acetate hoặc kháng sinh vào môi trường nuôi cấy. Mẫu được cấy vào môi trường và ủ trong 7 - 10 ngày ở 37C với 5% CO2. Kết quả của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn là các khuẩn lạc li ti với hình trứng ốp la - “fried egg” - do trung tâm của khuẩn lạc có xu hướng ăn sâu vào trong thạch và bao bọc bởi lớp sinh trưởng bề mặt (khi quan sát dưới kính hiển vi soi nổi). 1.1.1.2. Đặc tính sinh hóa và tính chất bắt màu thuốc nhuộm Các tác giả Nicholas và Ayling (2003) cho rằng một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn M. bovis phân lập từ bò bao gồm: không có khả năng phân giải glucose cũng như arginine, có khả năng phân giải tetrazolium ở cả điều kiện nuôi cấy yếm khí cũng như hiếu khí. 4 Do không có cấu trúc thành tế bào nên việc nhuộm Gram với vi khuẩn Mycoplasma không hiệu quả (John và cs., 2011). Để nhuộm, người ta sử dụng kỹ thuật nhuộm ADN, kỹ thuật này thường được sử dụng trong việc xác định tạp nhiễm Mycoplasma khi nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, các kỹ thuật nhuộm thường ít được áp dụng trong nuôi cấy, xác định hình thái vi khuẩn Mycoplasma. 1.1.1.3. Đặc tính gây bệnh Theo Razin và cs. (1998) cơ chế gây bệnh của một số loài Mycoplasma vẫn chưa được biết một cách rõ ràng, đa số vi khuẩn Mycoplasma thường tồn tại hội sinh, hài hòa cùng vật chủ. Tuy nhiên, một số vi khuẩn Mycoplasma có yếu tố gây bệnh. Trong nhiều trường hợp các biểu hiện cơ bản của bệnh thường là do sự phá hủy hệ thống miễn dịch và phản ứng viêm của vật chủ hơn là ảnh hưởng trực tiếp từ chính vi khuẩn này. Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra các yếu tố có tính chất gây bệnh của vi khuẩn Mycoplasma như: yếu tố bám dính, giáp mô, sản sinh độc tố, làm tiêu tan cơ chất của tế bào vật chủ, khả năng tránh hàng rào miễn dịch của vật chủ. * Yếu tố bám dính Thomas và cs. (1991) cho biết: tính bám dính của vi khuẩn lên tế bào bạch cầu và đại thực bào theo các nồng độ khác nhau, các tế bào bạch cầu trung tính bị vi khuẩn bám dính, không phản ứng với vi khuẩn sau 75 phút thực nghiệm. Tính bám dính của vi khuẩn M. bovis phụ thuộc vào cấu trúc của protein bề mặt - PvpA và tương đồng với các vi khuẩn Mycoplasma khác (Boguslavsky và cs., 2000). Pfutzner và Sachse (1996) cũng cho biết khả năng bám dính của vi khuẩn M. bovis lên tế bào phổi của phôi bò và kết luận rằng tỷ lệ bám dính phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và các protein bề mặt có liên quan khác (VSPS), đặc biệt là P26. Tác giả Guo và cs. (2017) cho rằng một protein có là TrmFO (methylenetetrahydrofolate tRNA - (uracil -5-)-methyltransferase) có đặc tính bám dính vào tế bào phổi phôi bò. Yếu tố bám dính là đặc tính gây bệnh đầu tiên của vi khuẩn lên tế bào vật chủ để thực hiện hoạt động xâm nhiễm, lẩn trốn đáp ứng miễn dịch (Xu và cs., 2022). * Sản sinh các chất gây độc Trong quá trình trao đổi chất, vi khuẩn Mycoplasma cũng sản sinh ra các chất gây độc đối với tế bào vật chủ như hydrogen peroxide (H2O2), các gốc superoxide, các chất độc có khối lượng phân tử cao. Các gốc superoxide và H2O2 gây ra các tổn thương ở 5 màng tế bào vật chủ (Razin và cs., 1998). H2O2 được coi là yếu tố gây bệnh chính của một số loài Mycoplasma, chất tiết này làm chết tế bào, ức chế hoạt động của lông mao hoặc phản ứng phân hủy ô xi hóa khử chất béo (Pilo và cs., 2005; Hames và cs., 2009). * Sự xâm nhập tế bào Đặc tính xâm nhập vào tế bào lông nhung khí phế quản của vật chủ (được mô tả ở hình 1.1) của vi khuẩn M. bovis được Howard và cs. (1987) đưa ra khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trong thực tế tại các đàn bò nhiễm bệnh, có sự nhân lên của vi khuẩn trong tế bào này. Rodríguez và cs. (1996) cũng cho biết M. bovis tấn công và xâm nhập vào bào tương hệ thống tế bào lông nhung đường hô hấp và tồn tại lâu trong tế bào vật chủ. Vi khuẩn tấn hệ miễn dịch của vật chủ trong các trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính. M. bovis cũng có thể thâm nhập vào hệ thống tuần hoàn, và là nguyên nhân của bệnh viêm khớp. Khi tiến hành phân lập thấy vi khuẩn xuất hiện tại nhiều cơ quan khác nhau như gan, thận (theo Poumarat và cs., 1996 (dẫn theo Chakraborty và cs., 2014). Hình 1.1: Mô phỏng quá trình xâm nhập vào tế bào có nhân của Mycoplasma (Nguồn: Rottem, 2003) 6 * Tính kháng kháng sinh Mycoplasma đề kháng với các loại kháng sinh có xu hướng tác dụng thành tế bào (fosfomycin, glycopeptide hay nhóm β-lactam), nhóm sulfonamide, nhóm quinolone (thế hệ 1), trimethoprim, polymixin và rifampicin. Sự mẫn cảm bị suy giảm hoặc kháng 1 số nhóm kháng sinh đã được ghi nhận và báo cáo từ 1 số chủng Mycoplasma gây bệnh trong thú y như: M. gallisepticum và M. synoviae ở gia cầm; M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, và M. hyosynoviae ở lợn; M. bovis ở gia súc; và M. agalactiae ở gia súc nhai lại nhỏ. Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn cao nhất được ghi nhận đối với nhóm macrolide, sau đó là tetracycline. Tuy nhiên, đa số các chủng vi khuẩn Mycoplasma vẫn còn mẫn cảm với các kháng sinh fluoroquinolone, bên cạnh đó pleuromutilin là kháng sinh mẫn cảm nhất trong phòng thí nghiệm. Tần suất đề kháng cũng biến đổi tùy theo các chủng Mycoplasma, theo các quốc gia hoặc theo các nhóm động vật được lấy mẫu (Gautier-Bouchardon, 2018). 1.1.2. Vi khuẩn Klebsiella 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo và nuôi cấy Klebsiella là vi khuẩn có xu hướng tròn và dày hơn các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriacae, có dạng trực khuẩn thẳng với 1 đầu hơi tròn hoặc hơi nhọn, thường được tìm thấy ở dạng độc lập, bắt cặp hoặc chuỗi ngắn. Klebsiella là vi khuẩn Gram âm, không di động (trừ Klebsiella mobilis), chúng có thể hình thành giáp mô nhưng không sinh nha bào. Kích thước trung bình của vi khuẩn rộng 0,3 tới 1,5µm và dài 0,6 tới 6µm. Trên môi trường thạch máu, vi khuẩn không gây dung huyết hoặc dung huyết rất nhẹ dạng gamma. Khuẩn lạc có dạng nhầy ướt, mức độ nhầy ướt tùy thuộc vào nguồn carbohydrate trong môi trường cũng như chủng vi khuẩn với nhau (Yu và cs., 2007). Trên môi trường thạch MacConkey, khuẩn lạc có màu hồng cánh sen đặc trưng (là kết quả của phản ứng phân giải lactose và sản sinh axit). Trên môi trường canh thang lỏng có nguồn peptone từ động vật, vi khuẩn phát triển và làm đục môi trường. 1.1.2.2. Đặc tính sinh hóa và tính chất bắt màu thuốc nhuộm Salauddin và cs. (2019) cho biết: đặc điểm sinh hóa học chính của Klebsiella bao gồm không sản sinh indole, phản ứng MR (methyl-red) âm tính, phản ứng VP 7 (Voges-Proskauer) dương tính. Vi khuẩn có khả năng phân giải citrate trong quá trình sinh trưởng và phản ứng catalase dương tính. Trên môi trường đa đường như TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Klebsiella gây đổi màu phần thạch nghiêng thành màu vàng (lên men đường lactose và sucrose), phần thạch đứng đổi sang vàng (lên men đường glucose) và có sinh hơi làm vỡ thạch. Tuy nhiên vi khuẩn không có khả năng sản sinh H2S (Sivakumar và cs., 2016). Một số đặc trưng sinh hóa của vi khuẩn Klebsiella được tổng hợp tại bảng 1.1. Bảng 1.1: Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Klebsiella Chỉ tiêu Kết quả Sản sinh indole Âm tính Lên men glucose Dương tính Lên men sucrose Dương tính Lên men lactose Dương tính Sản sinh H2S Âm tính Phản ứng oxidase Dương tính hoặc âm tính Phân giải citrate Dương tính Phản ứng VP Dương tính Phản ứng MR Âm tính Khả năng di động Dương tính hoặc âm tính Sinh hơi Dương tính (Nguồn: Salauddin và cs. (2019); Sivakumar và cs., 2016) Vi khuẩn Klebsiella là vi khuẩn Gram âm nên khi thực hiện nhuộm màu tiêu bản bằng bộ thuốc nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học thấy vi khuẩn bắt màu đỏ. 1.1.2.3. Đặc tính gây bệnh * Kháng nguyên K (Capsular polysaccharide - CPS) Theo Ørskov 1984 (dẫn theo Podschun và Ullmann, 1998) cho biết: vi khuẩn Klebsiella thường sản sinh giáp mô có cấu trúc phức hợp từ những polysaccharide có tính axit. Chúng thường chứa từ 4 tới 6 phân tử đường và các phân tử axit uronic, có thể phân loại thành 77 kiểu huyết thanh (hình 1.2). Giáp mô có vai trò quan trọng 8 trong việc gây bệnh của vi khuẩn (Amako và cs., 1988), bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tiêu diệt (thực bào) của bạch cầu hạt đa nhân, và ngăn cản sự tiêu diệt của yếu tố diệt khuẩn trong huyết thanh (Williams và cs., 1983). Cấu trúc của giáp mô làm giảm đáng kể khả năng bám dính của vi khuẩn lên tế bào lông nhung khi so sánh giữa chủng có với chủng không có lớp này. Bên cạnh đó, có hay không có giáp mô không ảnh hưởng tới việc xâm nhiễm đường tiêu hóa, còn đối với đường tiết niệu thì giáp mô đóng vai trò độc lực quan trọng (Struve và Krogfelt, 2003). Hình 1.2: Các yếu tố gây bệnh của Klebsiella (Nguồn: Podschun và Ullmann, 1998) * Kháng nguyên O (Lipopolysaccharide - LPS) LPS của vi khuẩn Klebsiella đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh, đặc biệt là Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) bởi nó là 1 trong những cấu trúc bề mặt của vi khuẩn giúp nó chống lại quá trình thực bào và góp phần bảo vệ vi khuẩn khỏi hệ thống bổ thể của vật chủ (Podschun và Ullmann, 1998). Tuy nhiên, cơ chế chính xác của đặc tính này như thế nào thì vẫn chưa được làm rõ. Bên cạnh đa dạng về protein bề mặt thì kháng nguyên CPS và LPS được đề cập nhiều nhất (Williams và cs., 1983; Ciurana và Tomas, 1987) về cấu trúc bề mặt và là yếu tố độc lực chính của vi khuẩn K. pneumoniae, chúng có liên quan tới việc tấn công, xâm nhiễm lớp niêm mạc. Cấu trúc bề mặt này đóng vai trò cơ bản trong việc tương tác qua lại với hệ