Luận án Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TIỀN TIẾN NAM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH DỊCH HÓA, ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ETHANOL ĐỒNG THỜI Ở NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ CAO TỪ GẠO LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TIỀN TIẾN NAM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH DỊCH HÓA, ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ETHANOL ĐỒNG THỜI Ở NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ CAO TỪ GẠO Ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 9540101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Chu Kỳ Sơn 2. TS. Phạm Tuấn Anh Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tiền Tiến Nam Tập thể GVHD 1. PGS.TS. Chu Kỳ Sơn 2. TS. Phạm Tuấn Anh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học là PGS. TS. Chu Kỳ Sơn và TS. Phạm Tuấn Anh đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Đại học Bách khoa Hà Nội cũng như bạn bè, đồng nghiệp đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin cảm ơn Phòng Đào tạo của Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện để tôi tham gia học tập và luôn ủng hộ vật chất, tinh thần trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thực hành thí nghiệm - Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP. Hồ Chí Minh cùng các sinh viên đã giúp đỡ tôi trong các nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động viên và khích lệ cho tôi có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tiền Tiến Nam iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. x MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 Tình hình sản xuất cồn trên thế giới và Việt Nam ...................................... 4 Tình hình sản xuất cồn trên thế giới ............................................................. 4 Tình hình sản xuất cồn ở Việt Nam .............................................................. 5 Một số công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột hiện nay ....... 6 Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt ...................................................... 7 Nguyên liệu sản xuất cồn ............................................................................ 11 Nguồn cơ chất trong sản xuất cồn .............................................................. 11 Nguyên liệu gạo trong sản xuất cồn ........................................................... 12 Enzym trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột ............................ 16 Nấm men dùng trong công nghệ sản xuất cồn ........................................... 22 Các yếu tố công nghệ và cơ chế thủy phân nguyên liệu trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt nồng độ chất khô cao .................................................... 26 Ảnh hưởng của chế độ nghiền và kích thước nguyên liệu ......................... 26 Ảnh hưởng của nồng độ enzym thủy phân nguyên liệu sống .................... 27 Cơ chế thủy phân của enzym trên nguyên liệu trong quy trình SLSF-VHG .................................................................................................................... 27 Động học trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ............................. 30 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ............................................................... 31 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ................................................................ 32 Ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ khác ........................................... 32 Tình hình ứng dụng quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ...................... 33 Ứng dụng chân không tách cồn đồng thời trong quá trình lên men ........ 34 iv NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................................ 38 Nguyên vật liệu ............................................................................................ 38 Gạo .............................................................................................................. 38 Chế phẩm enzym ........................................................................................ 38 Chế phẩm nấm men .................................................................................... 39 Chất bổ sung ............................................................................................... 39 Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ...................................................... 39 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 40 Nội dung 1: Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao. ....................................................... 40 Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG. ........................................ 40 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy mô 100 L dịch lên men.................................................................................. 40 Nội dung 4: Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG. ......................................................................... 41 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 41 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 42 Phương pháp phân tích ............................................................................... 49 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu thực nghiệm ................................. 53 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 54 Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình SLSF-VHG .............. 54 Lựa chọn gạo cho quy trình SLSF-VHG .................................................... 54 Lựa chọn enzym đường hóa phụ trợ cho quy trình SLSF-VHG ................ 57 Lựa chọn chế phẩm nấm men ..................................................................... 59 Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG .............................................................. 64 Lựa chọn kích thước lưới nghiền bột gạo ................................................... 64 Ảnh hưởng của nồng độ enzym đường hóa chính (Stargen 002) ............... 66 Ảnh hưởng nguồn nitơ ................................................................................ 69 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ............................................................... 81 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ................................................................ 83 v Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cồn SLSF-VHG ở quy mô phòng thí nghiệm (1 L dịch lên men) .............................................................................. 85 Động học của quá trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao .................................................................................................................... 87 Hình thái, cấu trúc bột gạo trong quy trình SLSF-VHG ............................ 91 Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy mô 100 L dịch lên men .................................................................................................. 95 Nghiên cứu quy trình SLSF-VHG quy mô 100 L dịch lên men ................ 96 Thống kê điện, nước và chi phí sản xuất cồn ở quy mô 100 L ................ 100 Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG ............................................................................................ 102 Ảnh hưởng của thời gian chưng cất chân không đến hiệu suất và thời gian lên men ............................................................................................................... 102 Nghiên cứu nâng cao nồng độ chất khô trong quy trình SLSF-VHG bằng chưng cất chân không ......................................................................................... 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 112 Kết luận .................................................................................................................. 112 Kiến nghị ................................................................................................................ 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............. 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 115 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 1 vi DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt SLSF Simultaneous liquefaction, saccharification and fermentation Dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời VHG Very high gravity Nồng độ chất khô cao SSF Simultaneous saccharification and fermentation Đường hóa và lên men đồng thời DP Degree of polymerization Độ trùng hợp (chiều dài mạch) RF Rice flour Bột gạo tb cells Tế bào CFU Colony form units Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNS 3,5-Dinitrosalicylic acid Thuốc thử DNS SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét XRD X-ray diffraction Phổ nhiễu xạ tia X CrI Crystallinity Index Chỉ số tinh thể GA Glucoamylase Enzym glucoamylase μmax Maximum specific growth rate Tốc độ tăng trưởng riêng cực đại QP Ethanol productivity Tốc độ tạo cồn YP/S The yield coefficient of ethanol production Hiệu suất tạo sản phẩm/đơn vị cơ chất HSLM Fermentation yield Hiệu suất lên men GAU Glucoamylase unit Đơn vị hoạt độ enzym glucoamylase SAPU Spectrophotometric acid protease units Đơn vị hoạt độ enzym protease vii HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao GC Gas chromatography Sắc ký khí kDa Kilodalton Kilodalton TCVN Vietnamese National Standards Tiêu chuẩn Việt Nam FAN Free amino nitrogen Nitơ amin tự do v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích w/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng AML Amigase Mega L SC Spirizyme DA Distillase ASP ER Ethanol Red TD Thermosacc Dry AS Angel super alcohol CK Dry solid Chất khô SBD Starch - binding domain Vùng gắn tinh bột CD Catalytic domain Vùng xúc tác cs et al. Cộng sự SLSFD Simultaneous liquefaction, saccharification and fermentation and distillation Dịch hóa, đường hóa và lên men chưng cất đồng thời viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tình hình sản xuất cồn trên thế giới ........................................................... 4 Hình 1.2 Sản lượng cồn nhiên liệu theo quốc gia năm 2021 ..................................... 5 Hình 1.3 Quy trình sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng .............................................. 7 Hình 1.4 Quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao ............................................................................................................................. 10 Hình 1.5 Hình ảnh tinh bột gạo [73] ........................................................................ 14 Hình 1.6 Cấu tạo bột gạo [68,73] ............................................................................. 16 Hình 1.7 Cấu tạo enzym α-amylase [99,102] .......................................................... 17 Hình 1.8 Cơ chế phân cắt nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn Bacillus [104] .................................................................................................................................. 18 Hình 1.9 Cấu tạo glucoamylase từ A. niger [96] ..................................................... 18 Hình 1.10 Cơ chế thủy phân của glucoamylase [109,110] ...................................... 19 Hình 1.11 Cơ chế thủy phân của enzym Stargen 001 trên tinh bột ngô [32] .......... 28 Hình 1.12 Hình thái bột sắn bị thủy phân [162] ...................................................... 29 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm xác định loại gạo, enzym đường hóa phụ trợ, nấm men .................................................................................................................................. 42 Hình 2.2 Mô hình thí nghiệm lên men và chưng cất cân không tách cồn đồng thời [173] .......................................................................................................................... 48 Hình 3.1 Biến đổi nồng độ cồn theo loại gạo trong quy trình SLSF-VHG ............. 55 Hình 3.2 Ảnh hưởng enzym phụ trợ đến đường tổng, độ cồn ................................. 58 Hình 3.3 Biến đổi độ cồn và đường tổng (a), đường khử (b) theo loại nấm men ... 60 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng của nấm men ER, TD và AS ............................ 62 Hình 3.5 Hình ảnh tế bào nấm men ER, TD và AS ................................................. 63 Hình 3.6 Phân bố kích thước hạt theo kích thước lưới nghiền ................................ 64 Hình 3.7 Nồng độ cồn theo kích thước lưới nghiền ................................................ 65 Hình 3.8 Biến đổi đường tổng-độ cồn (a), đường khử (b) theo nồng độ enzym Stargen 002 ............................................................................................................... 67 Hình 3.9 Ảnh hưởng urea và protease đến độ cồn - đường tổng (a), đường khử (b) .................................................................................................................................. 70 Hình 3.10 Biến đổi protein hòa tan (a), FAN (b) trong dịch lên men ..................... 72 ix Hình 3.11 Ảnh hưởng của urea và protease đến đường cong sinh trưởng nấm men .................................................................................................................................. 77 Hình 3.12 Ảnh SEM của bột gạo ở 24 h lên men (a)-R, (b)-U, (c)-P và (d)-UP ..... 77 Hình 3.13 Ảnh hưởng của urea và protease đến kích thước lỗ trên bề mặt bột gạo 78 Hình 3.14 Biến đổi cấu trúc bột gạo qua phổ XRD. (a)-R, (b)-U, (c)-P, (d)-UP .... 80 Hình 3.15 Đường cong sinh trưởng theo mật độ nấm men ..................................... 83 Hình 3.16 Biến đổi nồng độ cồn theo mật độ nấm men .......................................... 84 Hình 3.17 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất cồn SLSF-VHG ở quy mô 1 L dịch lên men ..................................................................................................................... 85 Hình 3.18 Biến đổi thành phần đường tan trong dịch lên men ................................ 88 Hình 3.19 Biến đổi sinh khối, tỉ lệ tế bào sống, nảy chồi trong quá trình lên men . 90 Hình 3.20 Ảnh SEM hình thái bột gạo ở các chế độ khác nhau .............................. 92 Hình 3.21 Biến đổi thành phần amylose trong bột gạo ........................................... 95 Hình 3.22 Biến đổi độ cồn, đường tổng đường khử quy mô 100 L dịch lên men ... 96 Hình 3.23 Đường cong sinh trưởng nấm men ở quy mô 100 L dịch lên men ......... 97 Hình 3.24 Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian chưng cất chân không ................. 102 Hình 3.25 Ảnh hưởng thời gian chưng cất chân không đến mật độ nấm men ...... 103 Hình 3.26 Biến đổi pH trong quá trình áp dụng chưng chân không theo nồng độ chất khô ................................................................................................................... 105 Hình 3.27 Đường tổng (a), đường khử (b) khi áp dụng chưng cất chân không ở các nồng độ chất khô khác nhau ................................................................................... 106 Hình 3.28 Biến đổi nồng độ cồn trong quá trình lên men và chưng cất chân không ................................................................................................................................ 107 Hình 3.29 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong lên men và chưng cất chân không đến mật độ tế bào nấm men. ........................................................................ 109 Hình 3.30 Biến đổi nồng độ glycerol ở nồng độ chất khô khác nhau trong lên men và chưng cất chân không ........................................................................................ 110 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của gạo [68] ............................................................. 13 Bảng 1.2 Nguồn vi sinh vật tạo α – amylase............................................................ 17 Bảng 1.3 Nguồn và đặc điểm một số GA [96] ......................................................... 19 Bảng 1.4 Một số chế phẩm enzym thương mại dùng trong sản xuất cồn ................ 21 Bảng 1.5 Một số chế phẩm enzym protease thương mại dùng trong sản xuất cồn . 22 Bảng 1.6 Một số chế phẩm nấm men thương mại dùng trong sản xuất cồn ............ 26 Bảng 1.7 Tình hình ứng dụng công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt .................. 33 Bảng 2.1 Tổng hợp nguyên liệu gạo sử dụng cho nghiên cứu ................................. 38 Bảng 2.2 Thông số các enzym sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 38 Bảng 2.3 Các chế phẩm nấm men sử dụng trong nghiên cứu .................................. 39 Bảng 2.4 Lựa chọn cố định một số yếu tố trong quy trình SLSF-VHG .................. 41 Bảng 2.5 Hoạt độ và lượng sử dụng của enzym phụ trợ .......................................... 43 Bảng 2.6 Thành phần thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ .......................... 44 Bảng 2.7 Chế độ chưng cất chân không với nồng độ chất khô khác nhau .............. 49 Bảng 2.8 Cách tính các thông số hóa lý, vật lý trong quá trình lên men ................. 52 Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng các loại gạo dùng cho sản xuất cồn ................... 54 Bảng 3.2 Chi phí nguyên liệu cho sản xuất cồn (quy về 1 L cồn tuyệt đối) ............ 56 Bảng 3.3 Ảnh hưởng enzym đường hóa phụ trợ đến đường khử ............................ 59 Bảng 3.4 Thông số quá trình lên men của nấm men ER, TD và AS ....................... 61 Bảng 3.