Luận án Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi
Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty được di nhập vào Việt Nam từ những năm 90 của thế kỷ trước và hiện đang được phát triển nuôi trồng tại một số địa phương như Nha Trang - Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Hiện rong sụn chủ yếu được người dân thương mại hóa dưới dạng rong khô nguyên liệu bán cho thương lái nước ngoài, đặc biệt là thương lái Trung Quốc [21], [26], [39]. Rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty là loại rong giàu car - một loại polysacharid có hoạt tính sinh học và được sử dụng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Hàm lượng car của rong sụn lên tới 40% trọng lượng chất khô [2], [6], [34], [37]. Hiện có nhiều nghiên cứu sản xuất car từ rong sụn và đa số các nghiên cứu sản xuất car từ rong sụn tại Việt Nam và trên thế giới đều sử dụng phương pháp hóa học để xử lý rong trong quá trình chiết car. Từ car người ta có thể thủy phân tạo thành oligocar - một loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học và có nhiều ứng dụng trong dược học, y học và thực phẩm như làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm, kích thích sinh trưởng thực vật, hoạt tính chống oxy, hỗ trợ phòng chống và điều trị viêm loét dạ dày, [34], [35], [36], [38]. Hiện có nhiều kỹ thuật thủy phân car thành oligocar như: phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng tia bức xạ hay phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase. Phương pháp hóa học là phương pháp sử dụng các chất hóa học để phân cắt car thành oligocar. Phương pháp này có nhược điểm là sau khi sản xuất, hóa chất lẫn với oligocar nên quá trình tinh sạch oligocar tốn kém. Trong khi đó, phương pháp sử dụng tia bức xạ đòi hỏi phải có thiết bị bức xạ mà các phòng thí nghiệm thông thường không có. Phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase xử lý rong sụn để sản xuất car và sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân car tạo ra các oligocar có ưu điểm là ít gây ô nhiễm môi trường và người ta dễ dàng tinh sạch car cũng như oligocar khỏi enzyme polysaccharase. Chính vì thế, sản phẩm car và oligocar sản xuất theo phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase được gọi là sản phẩm sản xuất theo công nghệ “sạch”. Vì thế, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase để xử lý rong sụn trong sản xuất car và sử dụng enzyme polysaccharase phân cắt car thành oligocar đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Do vậy, luận án tiến hành “Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi”
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................................ i
DANH MỤC KÝ HIỆU................................................................................................. iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH.............................................................................................. ix
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..........................................xiv
MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN......................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN............... 3
1.1.1. Giới thiệu về rong sụn........................................................................................... 3
1.1.2. Giới thiệu về carrageenan ..................................................................................... 4
1.1.3. Tính chất lý hoá của carrageenan.......................................................................... 7
1.1.4. Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan ................................................ 10
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ
OLIGOCARRAGEENAN ............................................................................................ 13
1.2.1. Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam.......................................... 13
1.2.2. Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài........................................ 14
1.3. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE ............................................ 14
1.3.1. Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan từ rong sụn.... 14
1.3.2. Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan.... 16
1.4. MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN...17
1.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA
CARRAGEENAN......................................................................................................... 19
1.5.1. Phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan ...................................... 19
1.5.2. Nghiên cứu cấu trúc của carrageenan ................................................................. 22
1.6. GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT..................................................... 24
ii
1.7. SURIMI VÀ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CARRAGEENAN, OLIGOCARRAGEENAN
TRONG SẢN XUẤT SURIMI................................................................................................26
1.7.1. Giới thiệu về surimi............................................................................................. 26
1.7.2. Nghiên cứu ứng dụng carrageenan và oligocarrageenan trong đồng tạo gel thực phẩm.. 30
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 32
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU............................................................................................ 32
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................... 33
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu và phân tích ..................................................................... 33
2.2.2. Phương pháp tinh sạch, xác định cấu trúc và độc chất ....................................... 35
2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................................ 41
2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ........... 56
2.4.1. Hóa chất .............................................................................................................. 56
2.4.2. Thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án............................................................... 56
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 57
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.................................. 58
3.1. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT
CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY...58
3.1.1. Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme viscozyme L........................ 58
3.1.2. Xác định chế độ chiết carrageenan ..................................................................... 66
3.2. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN....77
3.2.1. Xác định nhiệt độ tinh sạch................................................................................. 77
3.2.2. Xác định nồng độ ethanol kết tủa protein trong tinh sạch carrageenan .............. 78
3.2.3. Xác định chế độ kết tủa carrageenan trong dung dịch car sau kết tủa protein.... 80
3.2.4. Đề xuất quy trình tinh sạch carrageenan bằng ethanol ....................................... 82
3.3. NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CARRAGEENAN THÀNH OLIGOCARRAGEENAN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME POLYSACCHARASE ......................... 86
3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase thích hợp cho thủy phân carrageenan
thành oligocarrageenan ................................................................................................. 86
iii
3.3.2. Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân carrageenan
thành oligocar bằng enzyme Termamyl 120L .............................................................. 88
3.4. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC
CỦA OLIGOCARRAGEENAN................................................................................... 97
3.4.1. Xác định nhiệt độ tinh sạch................................................................................. 97
3.4.2. Xác định nồng độ ethanol kết tủa phân đoạn protein.......................................... 98
3.4.3. Xác định chế độ kết tủa oligocarrageenan trong dung dịch oligocarrageenan sau
kết tủa protein.............................................................................................................. 100
3.4.4. Đề xuất quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng ethanol ............................. 103
3.4.5. Đánh giá độ sạch của oligocarrageenan tinh sạch............................................. 104
3.4.6. Xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocarrageenan.................................. 107
3.5. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC CHẤT HỌC CỦA CARRAGEENAN VÀ
OLIGOCARRAGEENAN .......................................................................................... 121
3.5.1. Đánh giá độc tính liều đơn ................................................................................ 121
3.5.2. Đánh giá độc tính liều lặp lại ............................................................................ 125
3.6. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN
TRONG SẢN XUẤT SURIMI TỪ CÁ ĐỔNG ......................................................... 134
3.6.1. Thử nghiệm sử dụng carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng ................ 134
3.6.2. Thử nghiệm sử dụng oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng........ 145
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 157
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................................ 159
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 160
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC KÝ HIỆU
: Kappa
: Iota
: Lambda
v/w : Thể tích/khối lượng
v/v : Thể tích/thể tích
kDA : kilodalton
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BLO: hồng cầu hoặc máu ẩn
BIL: bilirubin
Car: Carrageenan
ĐVTN: động vật thí nghiệm
EU: Liên minh châu Âu
GLEU: bạch cầu
GLU: đường niệu
JECFA: Ủy ban Chuyên gia về Phụ gia Thực phẩm
KPH: không phát hiện
KET: Ketin
Liều TB: liều trung bình
MPV: thể tích tiểu cầu
NIT: Nitrit;
Oligocar: Oligocarrageenan
Pro: Protein
QCVN: quy chuẩn Việt Nam
SG: tỷ trọng
TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam
Thận T: thận trái
Thận P: thận phải
URO: Urobilin
w/v: khối lượng/thể tích
WFT: nước cất pha tiêm vô khuẩn
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn.......................................................4
Bảng 1.2. Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan..................................... 8
Bảng 1.3. Độ dịch chuyển hoá học sigma từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose
và galactose ...................................................................................................................21
Bảng 2.1. Thành phần hóa học chính của cá Đổng cờ..................................................33
Bảng 2.2. Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng.........................................................39
Bảng 2.3. Đánh giá các biểu hiện lâm sàng trên chuột thí nghiệm an toàn ..................39
Bảng 2.4. Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng không làm mù.................................40
Bảng 2.5. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính .............................41
Bảng 2.6. Nhiệt độ và pH tối thích của các enzyme .....................................................48
Bảng 3.1. Điều kiện thí nghiệm được chọn...................................................................58
Bảng 3.2. Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 3 .....................................58
Bảng 3.3. Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme Viscozyme L theo hàm
mục tiêu sức đông của carrageenan ..............................................................................61
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu hiệu suất thu car từ rong sụn ........63
Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc của hàm chập YL ...........................64
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu YL........................................65
Bảng 3.7. So sánh các thí nghiệm leo dốc theo từng hàm mục tiêu .............................65
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá chất lượng carrageenan theo phương pháp xử lý bằng
enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất .............................................................74
Bảng 3.9. Thành phần hóa học chính của mẫu carrageenan trước tinh sạch ................77
Bảng 3.10. Nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ đông đặc của carrageenan thô .................77
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong
kết tủa và trong dung dịch car sau tinh chế ........................................................................78
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa car và hàm lượng
protein, lipid, car còn lại trong dung dịch .....................................................................80
vii
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa carrageenan...................82
Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của carrageenan trước và sau tinh sạch ..84
Bảng 3.15. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của carrageenan trước và sau
tinh sạch.........................................................................................................................84
Bảng 3.16. Thành phần hóa học chính của mẫu oligocarrageenan trước tinh sạch......97
Bảng 3.17. Nhiệt độ đông đặc và tan chảy của oligocarrageenan thô ..........................98
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate
trong kết tủa và trong dung dịch oligocar sau tinh chế .................................................99
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa oligocarrageenan và
hàm lượng protein, lipid, oligocar còn lại trong dung dịch .........................................101
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa oligocarrageenan.........102
Bảng 3.21. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của oligocarrageenan trước và sau
tinh sạch.......................................................................................................................104
Bảng 3.22. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của oligocarrageenan trước và
sau tinh sạch ................................................................................................................105
Bảng 3.23. Kết quả phân tích thành phần hoá học của oligocarrageenan ..................110
Bảng 3.24. Một số dải hấp thụ chính trên phổ hồng ngoại .........................................111
Bảng 3.25. Độ dịch chuyển hoá học 13C-NMR...........................................................112
Bảng 3.26. So sánh độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan
chuẩn (của Hãng Sigma) ............................................................................................114
Bảng 3.27. Độ dịch chuyển hóa học của các proton ở vị trí α ...................................115
Bảng 3.28. Liên kết từ phổ 1H-1H COSY ...................................................................118
Bảng 3.29. Tương tác của các proton trên phổ ROESY .............................................120
Bảng 3.30. Độ dịch chuyển hoá học 13C NMR và 1H NMR của oligocarrageenan....121
Bảng 3.31. Biểu hiện lâm sàng của chuột nhắt uống carrageenan và oligocarrageenan ......122
Bảng 3.32. Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột lang .................................................127
Bảng 3.33. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 21 ngày .....128
viii
Bảng 3.34. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 42 ngày .....129
Bảng 3.35. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 21 ngày ... 130
Bảng 3.36. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 42 ngày ... 130
Bảng 3.37. Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần
giải phẫu thứ nhất (ngày 21) .......................................................................................131
Bảng 3.38. Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần
giải phẫu thứ hai (ngày 42) .........................................................................................132
Bảng 3.39. Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm ..........................................145
Bảng 3.40. Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm ..........................................156
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty............................3
Hình 1.2. Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose
pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose .........................................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc của κ-carrageenan.............................................................................6
Hình 1.4. Cấu trúc của -carrageenan..............................................................................6
Hình 1.5. Cấu trúc của -carrageenan.............................................................................6
Hình 1.6. Sự chuyển hóa mu-carrageenan thành κ-carrageenan trong môi trường kiềm...........7
Hình 1.7. Sự chuyển hóa nu-carrageenan thành - carrageenan trong môi trường kiềm ........7
Hình 1.8. Sự chuyển hóa -carrageenan thành theta-carrageenan trong môi trường kiềm ....7
Hình 1.9. Vị trí tồn tại của carrageenan trong rong sụn................................................15
Hình 1.10. Quá trình thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan..........................16
Hình 1.11. Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase .....................................17
Hình 2.1. Hình ảnh về nguyên liệu rong sụn (K. alvarrezii (Doty) Doty)....................32
Hình 2.2. Hình ảnh về cá đổng cờ (Nemipterus virgatus (Tanaka, 1916)) ...................32
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát của luận án ..............................................42
Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn.....................................43
Hình 2.5. Sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng NaOH.................46
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn được loại enzyme amylase thích hợp cho thủy
phân car thành oligocar ....................................................................................................... 48
Hình 2.7. Mô hình liên kết giữa carrageenan và protein...............................................50
Hình 2.8. Quy trình công nghệ sản xuất surimi ............................................................50
Hình 2.9. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan
đến chất lượng của surimi trong quá trình chế biến..................................................................53
Hình 2.10. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan
đến chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông .................................................54
x
Hình 2.11. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình hấp đến hiệu suất thu hồi surimi
theo thời gian bảo quản đông ........................................................................................55
Hình 2.12. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan
đến độ đồng nhất của surimi trong quá trình bảo quản đông........................................56
Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi carrageenan ...............66
Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan..........66
Hình 3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất thu nhận carrageenan ....................68
Hình 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan ..........68
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến hiệu suất thu carrageenan....................70
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến sức đông và độ nhớt của carrageenan ......70
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình sản xuất carrageenan từ rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty
bằng phương pháp sử dụng enzyme Viscozyme L.........................................................72
Hình 3.8. Hình ảnh vi ảnh hiển vi thành tế bào rong sụn sau khi xử lý NaOH và Viscozyme L..74
Hình 3.9. Hình ảnh về sản phẩm carrageenan sản xuất theo quy trình sử dụng NaOH
và quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong sụn..........................................75
Hình 3.10. Quy trình tinh sạch carrageenan tinh sạch car bằng cách sử dụng ethanol
960 để kết tủa phân đoạn protein và car ........................................................................83
Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan ban đầu ..............................................85
Hình 3.12. Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan ban đầu ............................................85
Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch......................................85
Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch....................................85
Hình 3.15. Ảnh hưởng của loại enzyme đến mức độ thủy phân carrageenan ..............87
Hình 3.16. Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử tạo thành ............87
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến hàm lượng đường
khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L ...............................................................89
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến mức độ thủy phân
carrageenan....................................................................................................................90
xi
Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH đến đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme
Temamyl 120L ..................................................................................................
