Luận án Nghiên cứu sản xuất vắc xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (epinephelus spp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 942 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Tâm PGS.TS. Đồng Văn Quyền Hà Nội, năm 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án ẫn HMMaanx ồng Phước Mẫn Hồng Phước ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS. TS. Đồng Văn Quyền (Viện Công nghệ sinh học) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn anh, chị đồng nghiệp phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học luôn hỗ trợ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành luận án này Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và đặc biệt là gia đình tôi. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Mẫn Hồng Phước Mẫn Hồng Phước iii MỤC LỤC Lời cam đoan ............................................................................................... i Lời cảm ơn .................................................................................................. ii Mục lục ........................................................................................................ iii Danh mục chữ viết tắt ................................................................................. vii Danh mục bảng .......................................................................................... x Danh mục hình ........................................................................................... xii MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Lý do chọn đề tài: ................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 3 3. Nội dung nghiên cứu: .............................................................................. 3 4. Đối tượng nghiên cứu: ............................................................................ 4 5. Phạm vi nghiên cứu: .............................................................................. 4 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: .............................................................. 4 7. Đóng góp mới của luận án: ..................................................................... 5 8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: .......................................................... 5 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 6 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú ..................................................... 6 1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú ................................................................. 6 1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................. 6 1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng ........................................................................ 7 1.1.4. Đặc điểm sinh sản ............................................................................. 8 1.2. Tình hình bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam . 9 1.2.1. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới ................................ 9 1.2.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú tại Việt Nam .............................. 10 1.3. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ............................................................ 12 1.4. Một số hiểu biết cơ bản về hệ miễn dịch của cá xương và vắc-xin ........ 18 iv 1.4.1. Đáp ứng miễn dịch của cá xương ..................................................... 18 1.4.2. Tổng quan về vắc-xin thủy sản ......................................................... 22 1.4.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá .......................................................................................................... 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 34 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 34 2.1.1. Cá bệnh.............................................................................................. 34 2.1.2. Cá thí nghiệm .................................................................................... 34 2.1.3. Tế bào ................................................................................................ 34 2.1.4. Hóa chất ............................................................................................ 34 2.1.5. Thiết bị .............................................................................................. 35 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 36 2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính ........................................................ 36 2.2.2. Phương pháp thu và xử lý mẫu ......................................................... 36 2.2.3. Kỹ thuật phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01 ......................... 37 2.2.4. Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số ...................................................... 38 2.2.5. Kỹ thuật RT - PCR ........................................................................... 38 2.2.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ............................................. 39 2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose ............................................... 39 2.2.8. Phương pháp giải trình tự AND ........................................................ 40 2.2.9. Phương pháp xác định TCID50 của NNV ......................................... 40 2.2.10. Phương pháp xác định LD50 của NNV ........................................... 41 2.2.11. Xác định điều kiện nhân giống vi rút .............................................. 42 2.2.12. Phương pháp bất hoạt vi rút ............................................................ 42 2.2.13. Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn ................................................. 43 2.2.14. Phương pháp trung hòa trên tế bào ................................................. 44 2.2.15. Phương pháp gây miễn dịch ............................................................ 44 v 2.2.16. Phản ứng ELISSA gián tiếp ............................................................ 45 2.2.17. Phương pháp thử thách cường độc ................................................ 46 2.2.18. Đánh giá độ an toàn vắc-xin ........................................................... 46 2.2.19. Đánh giá hiệu quả vắc-xin ở điều kiện thực nghiệm ...................... 47 2.2.20. Kiểm tra độ thuần khiết của vắc-xin bất hoạt ................................. 48 2.2.21. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 49 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 50 3.1. Kết quả phân lập và lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc- xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú. ................................................... 50 3.1.1. Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh ở miền Bắc .................................................................................................. 50 3.1.2. Xác định độc lực vi rút ( TCID50 và LD50) ........................................ 55 3.1.3. Kết quả lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú .......................................................................... 60 3.2. Kết quả chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh ........................ 70 3.2.1. Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào ....................................................... 70 3.2.2. Kết quả xác định điều kiện gây nhiễm vi rút. .................................. 73 3.2.3. Kết quả xác định điều kiện bất hoạt vi rút ........................................ 78 3.2.4. Xác định các điều kiện tạo vắc xin bán thành phẩm ......................... 85 3.3. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin ................................... 91 3.3.1. Đánh giá chỉ tiêu vật lý ................................................................... 92 3.3.2. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng .............................................................. 93 3.3.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn vắc-xin ................................................... 94 3.3.4. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin bán thành phẩm ................ 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 103 Kết luận ....................................................................................................... 103 Kiến nghị ..................................................................................................... 103 vi DANH MỤC CÔNG TRÌNH ........................................................................... 104 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................... 105 Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................... 105 Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................... 106 PHỤ LỤC ........................................................................................................... 134 Phụ lục 1: Kết quả sàng lọc mẫu cá nghi nhiễm NNV ............................... 134 Phụ lục 2: Trình tự gen T4 của 2 mẫu TB05 và HP02 ........................ 136 Phụ lục 3: Trình tự gen T4 của chủng NNV TB05 qua 10 đời cấy chuyển ................................................................................................................. 137 Phụ lục 4: Ảnh tiêm cá thí nghiệm .............................................................. 142 Phụ lục 5: Thử nghiệm vắc-xin cho cá giống ............................................. 142 Phụ lục 6: TCVN 8684:2011 ...................................................................... 143 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ và nghĩa Việt Aa Amino acid (axit amin) AH Aluminum hydroxide AP Aluminum phosphate ARN Ribonucleic acid (axit ribonucleic) BEI Benary ethylenimine BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn) Bp Base pair (cặp bazơ) BSA Bovine serum albumin (huyết thanh bò) cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào) CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) CNS Central nervous system (hệ thống thần kinh trung ương) cs Cộng sự Da Dalton DAB Diamino bezidine DNA Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic) EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay EPC Epithelioma papulosum cyprinid EtBr Ethidium bromide FBS fetal bovine serum (huyết thanh bào thai bò) FCA Freun´d complete adjuvant (chất bổ trợ hoàn chỉnh Freund) viii HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) kb Kilobase kDa Kilodalton GS Grouper spleen (lá lách cá mú) Ig Immunoglobulin (kháng thể) L-15 Leibovitz’s-15 LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50%) MHC Major Histocompatibility Complex (tổ hợp tương hợp mô chính) MMC Melanomacrophage (tế bào hắc tố) MOI Multiplicity of infection (Tỷ lệ lây nhiễm trùng) NCR Non coding region (vùng không mã hóa) ND Not done (không thực hiện) Nt Nucleotide NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh) OIE Office International des Epizooties (Tổ chức Thú y thế giới) ORF Open Reading Frame (khung đọc mở) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi Polymerase) PFU Plaque Forming Units (đơn vị hình thành vết tan) RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh ở cá mú đốm đỏ) RPS Relative percent survival (tỉ lệ bảo hộ) RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulphate SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn sọc) ix TAE Tris acetate EDTA TBS Tris Buffered Saline (đệm muối Tris) TBST TBS - Tween TCID50 Tissue culture infectious dose 50% (liều gây nhiễm 50% tế bào) TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh ở cá nóc hổ) UV Ultraviolet light (tia cực tím) VER Viral encephalopathy and retinopathy (vi rút gây bệnh não và võng mạc) VLPs Virus-like particles (các phần tử giống vi rút) VNN Viral Nervous Necrosis (bệnh hoại tử thần kinh) x DANH MỤC BẢNG TT Nội dung bảng Trang 1 Bảng 1.1. Một số vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú 30 2 Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc gen T4 trong các mẫu cá nghi nhiễm NNV 51 3 Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên tế bào GS01 53 4 Bảng 3.3. Kết quả xác định TCID50 trên tế bào GS01 56 5 Bảng 3.4. Kết quả xác định LD50 trên cá mú giống 58 6 Bảng 3.5. So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T4 59 7 Bảng 3.6. Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên của các mẫu 60 8 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của giống gốc 62 9 Bảng 3.8. Kết quả xác định hiệu giá vi rút của chủng giống gốc 63 10 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ ổn định của chủng NNV TB05 64 11 Bảng 3.10. Xác định pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào GS01 71 12 Bảng 3.11. Xác định mật độ tế bào ban đầu, thời điểm thu hoạch vi rút 71 13 Bảng 3.12. Hiệu giá vi rút khi gây nhiễm với liều khác nhau 74 14 Bảng 3.13. Kết quả tinh sạch vi rút bằng hệ thống lọc GLASSCO 76 15 Bảng 3.14. Hiệu suất thu hồi vi rút bằng lọc tiếp tuyến và siêu ly tâm 77 16 Bảng 3.15. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV 79 17 Bảng 3.16. Xác định nồng độ hóa chất β-propiolactone 82 xi 18 Bảng 3.17. Kết quả xác định vi rút sống tồn dư sau bất hoạt 84 19 Bảng 3.18. Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vắc-xin 92 20 Bảng 3.19. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vật lý của vắc-xin 92 21 Bảng 3.20. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin 93 22 Bảng 3.21. Xác định mức độ an toàn của vắc-xin 95 23 Bảng 3.22. Kết quả theo dõi các tế bào có chức năng miễn dịch 98 xii DANH MỤC HÌNH TT Nội dung hình Trang 1 Hình 1.1. Cấu trúc không gian của vi rút hoại tử thần kinh 13 2 Hình 1.2. Cấu trúc genome của vi rút hoại tử thần kinh 14 3 Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính 36 4 Hình 3.1. Mẫu cá mú ghi nhiễm vi rút NNV 50 5 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của một số mẫu nghi nhiễm 52 6 Hình 3.3. Hình ảnh tế bào GS01 53 7 Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra trên gen 65 8 Hình 3.5. So sánh trình tự gen T4 của 10 đời vi rút 68 9 Hình 3.6. Đông khô giống gốc vi rút NNV TB05 69 10 Hình 3.7. Ảnh hưởng môi trường đến mật độ tế bào 70 11 Hình 3.8. Tế bào trước và sau nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh 72 12 Hình 3.9. Kết quả xác định liều gây nhiễm MOI 74 13 Hình 3.10. Kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên 80 14 Hình 3.11. Biến động kháng thể ở cá với kháng nguyên bất hoạt 82 15 Hình 3.12. Biến động kháng thể đặc hiệu của cá với kháng nguyên sau bất hoạt (OD450) 84 16 Hình 3.13. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch với các liều kháng nguyên 86 17 Hình 3.14. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch trong các mức thời gian 87 18 Hình 3.15. So sánh mức độ bảo hộ cá với vắc-xin bất hoạt có chất bổ trợ khác nhau 89 19 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin 94 20 Hình 3.17. Mô não và võng mạc cá nhuộm hematoxylin và eosin 96 21 Hình 3.18. Tỷ lệ sống của cá ở các lô thử nghiệm vắc-xin 100 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam có điều kiện địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có bờ biển dài 3.260 km, 12 đầm phá eo vịnh, 112 cửa lạch và có hơn 600.000 ha vùng triều [244]. Đó là các điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nghề biển nói chung và nghề nuôi trồng thuỷ sản nói riêng. Ngành nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam và liên tục tăng trưởng trong những năm gần đây cả về diện tích và sản lượng. Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3 nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021 [243]. Một số loài cá có giá trị kinh tế được nuôi trồng như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp.) Sản lượng nuôi trồng cá biển đạt 58 nghìn tấn trên diện tích nuôi 6.000 ha [243]. Tuy nhiên, nghành nuôi trồng thủy sản trên thế giới cũng như ở Việt Nam luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt trong những năm gần đây, các bệnh do vi rút trên động vật thủy sản như bệnh xuất huyết cá trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân trên cá chép, bệnh Iridovirus trên cá mú, bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách và thận truyền nhiễm, hoại tử cơ quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng do vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho nuôi trồng thủy sản. Theo báo cáo của của Sneeringer và cộng sự, 2019, hàng năm 10% sản lượng động vật thuỷ sinh thất thoát do các bệnh truyền nhiễm, thiệt hại hơn 10 tỷ USD trên toàn cầu [198]. Ở Việt Nam, thiệt hại gây ra bởi dịch bệnh đối với ngành thủy sản gần 1 tỷ USD mỗi năm [17]. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) được phát hiện ở hầu hết các nước trên thế giới, gây ảnh hưởng đến hơn 120 loài cá biển [211], trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao. Bệnh đã được xác định là do vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra [17, 29]. Cá 2 mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: bơi lội không định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, cá bị bệnh có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết từ 80-100% [29, 154, 155]. Ở Việt Nam, bệnh hoại tử thần kinh xuất hiện ở hầu hết các vùng nuôi cá trên cả nước. Mùa vụ phát bệnh từ tháng 5 đến tháng 10, khi nhiệt độ nước dao động từ 24 đến 300C. Tỷ lệ chết do vi rút hoại tử thần kinh gây ra dao động từ 50-100% tùy thuộc theo loài và giai đoạn xuất hiện bệnh [3]. Số liệu từ nghiên cứu của trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh lên tới 82% mẫu cá bệnh thu thập [1, 4]. Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng có xu hướng gia tăng qua các năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời gian khởi phát kéo dài, vì thế, việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản là vấn đề cấp thiết [50, 199]. Kiểm soát dịch bệnh bằng chế phẩm vi sinh, chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày càng được ứng dụng nhiều