Luận án Nghiên cứu sàng lọc và biểu hiện pectinase từ nấm mốc trong pichia pastoris

i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ THANH DIỄM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN PECTINASE TỪ NẤM MỐC TRONG Pichia pastoris LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Huế, 2024 ii ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ THANH DIỄM NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN PECTINASE TỪ NẤM MỐC TRONG Pichia pastoris Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN QUỐC DUNG 2. PGS.TS. PHẠM THỊ NGỌC LAN Huế, 2024 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu và số liệu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc sử dụng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Các bài báo khoa học đƣợc công bố với sự đồng ý của các đồng tác giả, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn. Tác giả luận án Phan Thị Thanh Diễm iv LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Trần Quốc Dung, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm và PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Lan, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến cán bộ Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ môn Sinh học ứng dụng, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế; Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã hƣớng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Quảng Nam đã có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Thừa Thiên Huế, ngày tháng 8 năm 2024 Nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Diễm v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. iii LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ ix DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... xi DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................... xii MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .................................................................... 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .............................................................................. 3 2.1. Mục tiêu chung ............................................................................................... 3 2.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................................... 3 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 4 4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................................................ 4 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................. 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 5 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN .............................................................. 5 1.1.1. Khái niệm pectin ...................................................................................................... 5 1.1.2. Nguồn gốc pectin ..................................................................................................... 5 1.1.3. Cấu tạo phân tử pectin ............................................................................................. 7 1.1.4. Tính chất của pectin ................................................................................................. 8 1.2. SƠ LƢỢC VỀ PECTINASE .......................................................................... 9 1.2.1. Khái niệm .................................................................................................................. 9 1.2.2. Phân loại pectinase ................................................................................................. 10 1.2.3. Nguồn nguyên liệu để thu nhận pectinase ........................................................... 13 1.2.4. Ứng dụng của pectinase ......................................................................................... 14 1.3. TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC THUỘC CHI Aspergillus ......................... 20 1.3.1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 20 1.3.2. Đặc điểm chung ...................................................................................................... 21 vi 1.3.3. Nấm mốc thuộc chi Aspergillus sinh tổng hợp pectinase .................................. 22 1.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc sinh pectinase .............................................................................................................. 23 1.3.4.1. Nhiệt độ ................................................................................................................ 23 1.3.4.2. pH môi trƣờng ..................................................................................................... 24 1.3.4.3. Thành phần môi trƣờng ...................................................................................... 25 1.3.4.4. Thời gian nuôi cấy .............................................................................................. 27 1.4. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN P. pastoris .......................................................... 27 1.4.1. Hệ thống biểu hiện P. pastoris .............................................................................. 27 1.4.2. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp tƣơng đồng sử dụng P. pastoris ......................... 29 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE ....................................................................................................... 34 1.5.1. Thế giới ................................................................................................................... 34 1.5.2. Việt Nam ................................................................................................................. 40 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 44 2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT ....................................................................... 44 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 47 2.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase ........ 47 2.2.2. Xác định hàm lƣợng protein ...................................................................... 50 2.2.3. Xác định một số đặc điểm hình thái và định danh loài ....................................... 50 2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp pectinase ...................... 51 2.2.5. Tạo dòng gen mã hóa pectinase ............................................................................ 52 2.2.6. Biểu hiện gen AspPecA trong P. pastoris X33 .................................................... 55 2.2.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự biểu hiện pectinase tái tổ hợp ............ 58 2.2.8. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp ................................................................................. 59 2.2.9. Xác định trọng lƣợng phân tử của pectinase ....................................................... 60 2.2.10. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ pectinase tái tổ hợp .............. 60 2.2.11. Thử nghiệm ứng dụng pectinase tái tổ hợp ....................................................... 61 2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................................................... 63 vii Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 64 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP PECTINASE ....................................................................................................... 64 3.1.1. Phân lập và xác định số lƣợng tế bào nấm mốc có khả năng phân giải pectin 64 3.1.2. Sơ tuyển chủng nấm mốc phân giải pectin và xác định hoạt độ enzyme ......... 66 3.1.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm mốc ............................................ 72 3.1.4. Định danh các chủng nấm mốc ............................................................................. 75 3.1.5. Ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm mốc Aspergillus ............................................................................................ 76 3.2. TẠO DÒNG GEN PECTINASE VÀO HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN P. pastoris ............................................................................................................ 88 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................................ 88 3.2.2. Phân lập gen ............................................................................................................ 89 3.2.3. Tạo dòng các gen mã hóa pectinase trong vector pGEM®T-Easy ................... 90 3.2.4. Giải trình tự gen mã hóa pectinase ....................................................................... 92 3.2.5. Dự đoán cấu trúc không gian của enzyme pectinase tái tổ hợp ......................... 96 3.2.6. Tạo dòng gen cAspPecA vào vector biểu hiện pPICZαA ................................ 101 3.2.7. Biến nạp vào P. pastoris X33 .............................................................................. 104 3.2.8. Kiểm tra sự biểu hiện gen .................................................................................... 106 3.2.9. Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện của rAspPecA .......................................... 108 3.2.10. Khối lƣợng phân tử của rAspPecA .................................................................. 113 3.2.11. Đánh giá tính chất lý hóa của rAspPecA ......................................................... 117 3.2.12. Động học của rAspPecA ................................................................................... 124 3.3. THỬ NGHIỆM rAspPecA TRONG CHẾ BIẾN NƢỚC TRÁI CÂY VÀ KHẢ NĂNG BÓC VỎ TIÊU ........................................................................... 126 3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ rAspPecA đến quá trình làm trong nƣớc ép táo ..... 126 3.3.2. Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của rAspPecA ............................................ 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 132 1. KẾT LUẬN ................................................................................................... 132 viii 2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 132 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................... 156 PHỤ LỤC .......................................................................................................... 157 ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) Amp Ampicillin AOX Alcohol Oxidase AspPecA Gen pectinase A AspPecB Gen pectinase B AspPecC Gen pectinase C bp Base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool cAspPecA Gen pectinase A tổng hợp nhân tạo CAGR Compounded Annual Growth Rate (Tỷ lệ tăng trƣởng thêm hàng năm) CDS Coding Sequence CFU Colonie Forming Unit CMC Carboxylmethyl Cellulose CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide cs Cộng sự CP Czapek – pectin ĐC Đối chứng ĐKVPGP Đƣờng kính vòng phân giải pectin DNA Deoxyribonucleic acid DNS Dinitrosalicylic acid EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid FDA Food and Drug Administration (Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm của Mỹ) GRAS Generally Recognized As Safe ITS Internal transcribed spacer (Vùng đệm trong đƣợc sao mã) x IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB Môi trƣờng Luria Bertani NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Hoa Kỳ) OD Optical density (Mật độ quang) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PDA Potato Dextrose Agar PecA Pectinase A PecB Pectinase B PecC Pectinase C SDS-PAGE Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di gel sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide) SKK Sinh khối khô TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus YP Yeast peptone YPD Yeast peptone dextrose YPDS Yeast peptone dextrose sorbitol Zymogram Điện di cơ chất xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lƣợng pectin trong một số loại trái cây. ............................................ 6 Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng LB ................................................................... 45 Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng phân lập Czapek - Pectin .................................. 46 Bảng 2.3. Thành phần môi trƣờng YD .................................................................. 46 Bảng 2.4. Thành phần môi trƣờng YPD ................................................................ 46 Bảng 2.5. Trình tự nucleotide các mồi dùng để khuếch đại các gen AspPecA, AspPecB và AspPecC .................................................................................... 53 Bảng 3.1. Số lƣợng nấm mốc phân giải pectin trong các mẫu phân lập ............. 65 Bảng 3.2. Khả năng phân giải pectin của các chủng nấm mốc trên môi trƣờng thạch Czapek-pectin ................................................................................................. 67 Bảng 3.3. Sinh khối, đƣờng kính vòng phân giải pectin và hoạt độ pectinase của các chủng nấm mốc ....................................................................................... 69 Bảng 3.4. Dự đoán cấu trúc không gian và đặc điểm lý hóa của các enzyme pectinase tái tổ hợp ........................................................................................................ 97 xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo phân tử pectin và các nhóm chức............................................. 7 Hình 1.2. Sơ đồ phân loại pectinase. .................................................................. 10 Hình 1.3. Hoạt động của enzyme pectin methylesterase trên chuỗi polygalacturonic acid. ................................................................................... 11 Hình 1.4. Hoạt động của polygalacturonase trên chuỗi polygalacturonic acid. . 12 Hình 1.5. Các ứng dụng khác nhau của pectinase .............................................. 16 Hình 1.6. Hệ thống vector biểu hiện pPICZα A, B, C cho P. pastoris . ............. 30 Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn glucose ................................................................ 49 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế mồi khuếch đại toàn bộ trình tự các gen AspPecA, AspPecB và AspPecC. ................................................................................... 53 Hình 3.1. Nấm mốc trên môi trƣờng thạch Czapek-pectin. ................................ 66 Hình 3.2. Các chủng nấm mốc Aspergillus sơ tuyển trực tiếp có hoạt tính pectinase mạnh . ............................................................................................ 67 Hình 3.3. Vòng phân giải pectin của dịch pectinase tách từ các chủng nấm mốc tuyển chọn. .............................................................................................................. 70 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái và hiển vi của các chủng nấm mốc. ..................... 74 Hình 3.5. Cây phả hệ của các chủng nấm mốc phân lập đƣợc dựa trên trình tự ITS. ................................................................................................................ 75 Hình 3.6. Sinh khối khô của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn sau các khoảng thời gian nuôi cấy. ............................................................................. 78 Hình 3.7. Đƣờng kính vòng phân giải pectin của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn sau các khoảng thời gian nuôi cấy. ............................................ 78 Hình 3.8. Hoạt độ pectinase của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn sau các khoảng thời gian nuôi cấy. ..................................................................... 79 Hình 3.9. Sinh khối khô của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn ở các giá trị pH. ...................................................................................................... 80 xiii Hình 3.10. Đƣờng kính vòng phân giải pectin của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn ở các giá trị pH. ............................................................................ 81 Hình 3.11. Hoạt độ pectinase của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn ở các giá trị pH. ....................................................................................................... 81 Hình 3.12. Ảnh hƣởng nguồn carbon đến khả năng tích lũy sinh khối của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn. ...................................................... 84 Hình 3.13. Đƣờng kính vòng phân giải pectin của chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn ở các nguồn carbon khác nhau. .................................................. 84 Hình 3.14. Vòng phân giải pectin của dịch pectinase tách từ các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn với nguồn carbon nuôi cấy tối ƣu. .......................... 85 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng tích lũy sinh khối của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn. ................................................ 86 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính pectinase của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn. ................................................................. 87 Hình 3.17. Vòng phân giải pectin của pectinase tách từ các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn với nguồn nitrogen nuôi cấy tối ƣu. ........................ 87 Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm PCR các gen pectinase trên gel agarose 0,8%.. ....................................................................................................................... 90 Hình 3.20. Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc chứa pGEM®-T Easy-pectinase. ....................................................................................................................... 91 Hình 3.21. Điện di đồ sản phẩm phản ứng cắt bằng EcoRI. ............................... 91 Hình 3.22. So sánh trình tự amino acid suy diễn của ba gen AspPecA, AspPecB và AspPecC bằng công cụ Clustal Omega .................................................... 95 Hình 3.23. Dự đoán cấu trúc không gian của các pectinase tái tổ hợp bằng công cụ Phyre2.. ..................................................................................................... 98 Hình 3.24. Khả năng tiết enzyme pectinase tái tổ hợp ra ngoại bào đƣợc dự đoán bằng TMHMM Server v. 2.0. ....................................................................... 99 Hình 3.25. Vị trí N-glycosylation dự đoán của enzyme pectinase tái tổ hợp bằng công cụ NetNGlyc 1.0 Server. .................................................................... 100 xiv Hình 3.26. Trình tự nucleotide tổng hợp nhân tạo của gen cAspPecA đƣợc xác định từ vị trí nucleotide mã hóa trình tự peptide không bao gồm tín hiệu peptide và đƣợc làm nổi bật bằng các chữ cái màu trắng trên nền đen. ..... 101 Hình 3.27. Vị trí nhận biết