Luận án Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2019 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9 64 01 08 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ PGS. TS. Phạm Công Hoạt HÀ NỘI - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Phạm Hồng Quân ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, PGS.TS. Phạm Công Hoạt đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo, cán bộ Cục Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương và Ban quản lý dự án CDC đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Phạm Hồng Quân iii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Trích yếu luận án .............................................................................................................. x Thesis abstract ................................................................................................................. xii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ........................................................................... 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ......................................................................... 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Tình hình chăn nuôi lợn tại Việt Nam ................................................................ 4 2.2. Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra ở lợn nuôi ................................... 5 2.2.1. Giới thiệu về PCV2 ............................................................................................ 5 2.2.2. Dịch tễ học của bệnh do PCV2 ........................................................................... 8 2.2.3. Cơ chế sinh bệnh ................................................................................................ 9 2.2.4. Triệu chứng và bệnh tích ở lợn mắc PCV2 ...................................................... 11 2.2.5. Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2 ............................... 14 2.2.6. Chẩn đoán ......................................................................................................... 16 2.2.7. Phòng bệnh ....................................................................................................... 18 2.2.8. Điều trị .............................................................................................................. 22 2.3. Hiện tượng đồng nhiễm do PCV2 gây ra ......................................................... 22 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2 ....................................... 23 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 23 iv 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 29 Phần 3. Nội dung – Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu ........................................... 33 3.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 33 3.2. Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 33 3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 33 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 35 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 35 3.5.1. Phương pháp tính toán dung lượng mẫu ........................................................... 35 3.5.2. Phương pháp điều tra hồi cứu ........................................................................... 38 3.5.3. Phương pháp thu thập mẫu ............................................................................... 38 3.5.4. Phương pháp chiết tách ADN/ARN ................................................................. 38 3.5.5. Phương pháp Realtime PCR ............................................................................. 39 3.5.6. Phương pháp PCR ............................................................................................ 40 3.5.7. Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen ....................................... 41 3.5.8. Phương pháp phân tích trình tự gen .................................................................. 42 3.5.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại .................................................................. 42 3.5.10. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian ............................................................................................................ 42 3.5.11. Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền ............................................. 45 3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 45 Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận ................................................................... 46 4.1. Sự lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam ..................................................... 46 4.1.1. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương ................................. 46 4.1.2. Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi ........................... 52 4.1.3. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi ................ 53 4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra ............................. 56 4.2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 .......................................................... 59 4.2.1. Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2 ............................................................. 59 4.2.2. Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam .............................................. 60 4.2.3. Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam .................................. 64 4.2.4. Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian ................. 66 4.2.5. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam ............ 68 v 4.2.6. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam ............ 73 4.3. Hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus .............................................. 76 4.3.1. Kết quả xác định sự có mặt của một số virus đồng nhiễm ............................... 77 4.3.2. Kết quả nghiên cứu hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus ............... 83 4.3.3. Đặc điểm sinh học phân tử của loài virus mới đồng nhiễm với PCV2 ............ 87 Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 92 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 92 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 92 Những công trình của tác giả công bố có liên quan đến luận án .................................... 93 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 94 Phụ lục ........................................................................................................................ 112 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic CI Confidence Interval CS Cộng sự CSFV Classical Swine Fever Virus ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay IPMA Immunoperoxidase monolayer assay NaCl Natri clorua ORF Open Reading Frame PBS Phosphate – Buffered - Saline PCR Polymerase chain reaction PCV Porcine circovirus PCV1 Porcine circovirus type 1 PCV2 Porcine circovirus type 2 PCV3 Porcine circovirus type 3 PCVAD Porcine circovirus type 2-associated disease PDNS Porcine dermatitis and nephropathy syndrome PK15 Pig Kidney 15 PMWS Postweaning multisystemic wasting syndrome PPV Porcine parvovirus PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TTV Torque teno virus vii DANH MỤC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 2.1. Một số loại vắc xin phòng bệnh do PCV2 gây ra được phép nhập khẩu, lưu hành tại Việt Nam hiện nay ........................................................................... 20 3.1. Mồi sử dụng để phát hiện các virus nghiên cứu .................................................. 34 3.2. Trình tự mồi dùng chẩn đoán và giải trình tự gen PCV2 ..................................... 35 3.3. Trình tự mồi dùng giải trình tự gen PCV3 ........................................................... 35 3.4. Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu .............................................................. 37 3.5. Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2d dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian ......................................... 43 3.6. Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2b dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian ......................................... 44 4.1. Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương ................................... 47 4.2. Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô khác nhau trên địa bàn nghiên cứu ............................................................................................................ 52 4.3. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn .................................... 53 4.4. Trình tự gen được đưa trên Genbank ................................................................... 60 4.5. Motif đặc trưng genotype của PCV2 lưu hành ở Việt Nam ................................ 64 4.6. Kết quả xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm .............................................. 78 4.7. Kết quả xác định sự đồng nhiễm virus trong mẫu bệnh phẩm ............................. 83 viii DANH MỤC HÌNH Số hình Tên hình Trang 2.1. Phân bố tổng số lợn nuôi theo địa phương năm 2017 .......................................... 4 2.2. Cây phát sinh loài của PCV2 ................................................................................ 5 2.3. Cấu trúc PCV2 ...................................................................................................... 6 2.4. Khả năng bài tiết PCV2 ở lợn bị nhiễm ............................................................... 8 2.5. Phát triển của nhiễm PCV2 biểu hiện thành PCVAD ........................................ 10 2.6. Một số triệu chứng lâm sàng điển hình ở lợn nghi mắc PMWS ........................ 12 2.7. Một số triệu chứng bệnh tích điển hình ở lợn nghi mắc PMWS ........................ 13 2.8. Sự phân bố PCV2 trên thế giới ........................................................................... 24 2.9. Phân loại genotype của PCV2 ở Việt Nam ........................................................ 31 4.1. Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2 ........................................ 46 4.2. Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu .................................... 49 4.3. Một số triệu chứng điển hình ở lợn mắc PMWS ................................................ 57 4.4. Một số bệnh tích điển hình ở lợn mắc PMWS ................................................... 58 4.5. Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh có trình tự được phân tích ............................. 61 4.6. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam ...................... 62 4.7. Hệ tọa độ 2 chiều biểu diễn mối quan hệ gen giữa các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam ................................................................................................... 65 4.8. Phân bố các nhóm di truyền của PCV2 ở Việt Nam theo không gian và thời gian .............................................................................................................. 67 4.9. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2b giữa các nước ......................................................................................... 69 4.10. Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 1 xâm nhập vào Việt Nam ............................................................................................ 71 4.11. Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 2 xâm nhập vào Việt Nam ............................................................................................ 72 4.12. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d ........................ 74 4.13. Nguồn gốc, sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam.............................................................................. 75 ix 4.14. Kết quả PCR xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm .................................... 77 4.15. Các tỉnh có mẫu dương tính với các virus đồng nhiễm ...................................... 80 4.16. Sự phân bố theo không gian của virus đồng nhiễm PCV2 ................................. 86 4.17. Trình tự gen ORF2 của 5 chủng PCV3 phân lập tại Việt Nam .......................... 88 4.18. Khoảng cách di truyền giữa các chủng PCV3 của Việt Nam và thế giới ........... 89 4.19. Cây phát sinh chủng loại của PCV3 lưu hành ở Việt Nam ................................ 90 4.20. Quan hệ di truyền giữa PCV2 và PCV3 lưu hành ở Việt Nam .......................... 91 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Phạm Hồng Quân Tên luận án: Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại Việt Nam Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9 64 01 08 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định tỷ lệ lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam và xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN/ARN virus ở lợn nuôi tại Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn và dựa vào thuật toán thống kê. Phân tích mẫu bằng phương pháp realtime PCR/PCR để xác định mẫu nhiễm PCV2. Sử dụng chương trình tin sinh học Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999) để phân tích trình tự nucleotide. Sử dụng chương trình MEGA 7 (Tamura et al., 2013) để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA) để phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide gen ORF2 của 64 chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam từ 2004 đến 2017. Sử dụng phần mềm Quantum GIS để mô tả mức độ và sự phân bố của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam. Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại quá trình phát tán (dispersal pathway) của các chủng PCV2d theo không gian và thời gian (spatio-temporal dynamics), với các tham số của mô hình dựa theo kết quả nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009). Sử dụng chương trình SpreaD3 (Bielejec et al., 2016) để tính toán giá trị Bayes factor (cho biết mức tin cậy của dự đoán các con đường phát tán). Giá trị BF trong khoảng BF > 150, 3 < BF < 150 và 1 < BF < 3 lần lượt ứng với mức dự đoán có độ tin cậy cao, có căn cứ và chưa đủ căn cứ về con đường phát tán (Kass and Raftery, 1995). Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2010; so sánh sự sai khác giữa các yếu tố bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1). xi Kết quả chính và kết luận * Tỷ lệ lưu hành porcine circovirus type 2 (PCV2) ở Việt Nam: (i) Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở Việt Nam là 41,14%. Tỷ lệ lưu hành PCV2 tại 14 tỉnh dao động từ 16% đến 88%; (ii) Ở các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ lệ dương tính với PCV2 khác nhau, cụ thể tỷ lệ lưu hành PCV2 cao nhất ở những trại có mức quy mô đàn >500 con (47,5%), thấp nhất là trại có quy mô đàn từ 100 – 300 con (27,42%). (iii) Ở các nhóm tuổi lợn đều phát hiện được mẫu dương tính với PCV2, tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn thịt là cao nhất (45,16%), lợn con theo mẹ và lợn nái tương ứng là 39,58% và 32,35%. * Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) lưu hành ở lợn nuôi tại Việt Nam: Ở Việt Nam, chỉ có sự lưu hành genotype PCV2b bao gồm nhánh 1A/1B, nhóm tái tổ hợp và genotype PCV2d. Ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam, đều thấy sự hiện diện đồng thời nhiều nhóm di truyền của PCV2 ở một tỉnh, trong cùng một khoảng thời gian. Các chủng phân lập ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc, các chủng thuộc genotype PCV2d từ 2004 - 2017 đều có nguồn gốc đầu tiên từ Trung Quốc, nhưng nằm ở các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại. * Kết quả xác định sự đồng nhiễm porcine circovirus type 2 (PCV2) với một số virus: PCV2 đồng nhiễm