Luận án Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------------------------- HÀ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------------------------- HÀ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS LÊ THỊ THU HIỀN 2. PGS.TS NÔNG VĂN HẢI HÀ NỘI - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Thị Thu Hiền và PGS. TS. Nông Văn Hải. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả khác. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Hà Hồng Hạnh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thu Hiền - Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen là người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nông Văn Hải - Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, đặc biệt là tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Đa dạng sinh học hệ gen đã luôn quan tâm và giúp đỡ, góp ý cho tôi thực hiện và hoàn thành bản luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Chu Hoàng Hà và các cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện một số thí nghiệm tại Phòng. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, Th.S. Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh. Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi, chăm sóc, động viên giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu. Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới các bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi thực hiện luận án. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen” thuộc Chương trình Trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến năm 2020 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự trợ giúp quý báu của các chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Tác giả luận án iii MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... III DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... VI DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. VIII DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... IX MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO ............................................................ 4 1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao .............................................................. 4 1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao ..................................................................... 5 1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao ........................................................................ 8 1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao.................................................................................. 9 1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam ................................................................... 11 1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO ...... 12 1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phương pháp truyền thống .......................................................................................................................... 12 1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học .................................... 15 1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE ............................................................................... 26 1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên ............................................. 26 1.3.2 Chitinase ở một số đối tượng sinh vật .......................................................... 27 1.3.3 Vai trò của gen mã hóa chitinase .................................................................. 29 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 32 2.1 VẬT LIỆU ......................................................................................................... 32 2.1.1 Mẫu thực vật .................................................................................................... 32 2.1.2 Các vector và chủng vi khuẩn .......................................................................... 32 2.13. Hóa chất, thiết bị .............................................................................................. 33 2.2 PHƯƠNG PHÁP .................................................................................................. 34 2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao ............................ 34 iv 2.2.2 Các phương pháp liên quan đến phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các vector chuyển gen thực vật ........................................................................................ 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................................. 48 3.1 TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CA CAO NGHIÊN CỨU .................... 48 3.1.1 Thu thập mẫu ................................................................................................... 48 3.1.2 Xác định khả năng tạo mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao ....... 49 3.1.3 Xác định khả năng nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao..51 3.1.4 Cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp ........................................................................ 53 3.1.5 Cảm ứng tạo phôi soma thứ cấp ....................................................................... 55 3.1.6 Tạo cây ca cao in vitro hoàn chỉnh .................................................................. 57 3.1.7 Khả năng thích ứng cây ca cao in vitro ra vườn ươm ...................................... 60 3.1.8 Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao ............................................................... 62 3.2. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT ....................................................................................................... 63 3.2.1 Nhân và tạo dòng vùng gen TcChi1_W ........................................................... 63 3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ vector pCB301 ........................................................................................................... 70 3.2.3 Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector biểu hiện thực vật đã thiết kế ............................................................................................................. 73 3.2.4 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen chuyển trên cây thuốc lá ....................... 75 3.3 CHUYỂN GEN CHỈ THỊ GUS/GUSPLUS VÀO CÂY CA CAO ....................... 77 3.3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn, vector thích hợp và thời gian lây nhiễm vi khuẩn cho chuyển gen vào ca cao ........................................................................................ 78 3.3.2 Chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8 .................................... 80 3.3.3 Phân tích và đánh giá mô, cây chuyển gen ...................................................... 81 3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO ............................ 84 3.4.1 Biến nạp gen mã hóa chitinase vào dòng ca cao TD8 ..................................... 84 3.4.2 Kiểm tra cây ca cao chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử ...... 87 v 3.4.3 Quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào dòng ca cao TD8 .......... 89 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN ....................................................................................... 91 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 102 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................. 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 105 SUMMARY ..................................................................................................................... PHỤ LỤC ......................................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bệnh nấm ở cây ca cao. 10 Hình 2.1. Một số vector sử dụng trong nghiên cứu.. 32 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm. 34 Hình 2.3. Hoa ca cao 35 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và TDZ đến tỷ lệ tạo phôi từ nhị lép ở một số dòng ca cao nghiên cứu.. 50 Hình 3.2. Ảnh hưởng của kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép. 51 Hình 3.3. Mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa trên môi trường PCG và SCG. 52 Hình 3.4. Tỷ lệ tạo phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao. 54 Hình 3.5. Tái sinh phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao.. 54 Hình 3.6. Tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm... 56 Hình 3.7. Tái sinh phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm của phôi soma sơ cấp dòng ca cao TD8. 57 Hình 3.8. Tỷ lệ phôi soma sơ cấp tạo chồi và ra rễ.. 59 Hình 3.9. Tạo chồi và ra rễ từ phôi soma sơ cấp và thứ cấp 59 Hình 3.10. Tỷ lệ cây con sống trên các loại giá thể khác nhau sau 20 ngày 60 Hình 3.11. Các cây ca cao in vitro trên môi trường ra cây.. 61 Hình 3.12. Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao.. 62 Hình 3.13. Tách chiết DNA tổng số từ lá ca cao dòng TD3 63 Hình 3.14. Sản phẩm nhân vùng gen TcChi1-W và xử lý pJET+TcChi1-W/1, pJET+TcChi1-W/7 và pJET+TcChi1-W/13 bằng BglII trên gel agarose 0,8%.. 65 Hình 3.15. Trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-U phân lập từ dòng ca cao TD3 67 Hình 3.16. So sánh trình tự protein TcChi1 ở ca cao dòng TD3 với một số trình tự chitinase lớp I của một số loài thực vật khác. 69 Hình 3.17. Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 và sản phẩm xử lý BglII và NotI các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8%............ 70 vii Hình 3.18. Sơ đồ thiết kế vector pRTRA+TcChi1. 71 Hình 3.19. Kết quả thiết kế pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%... 72 Hình 3.20. Sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1.. 72 Hình 3.21. Sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel agarose 0,8% 73 Hình 3.22. Sản phẩm PCR gen TcChi1 từ pCB301+TcChi1 74 Hình 3.23. Điện di sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 từ thuốc lá 75 Hình 3.24. Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng thuốc lá chuyển gen TcChi1.. 76 Hình 3.25. Cây thuốc lá chuyển gen.... 77 Hình 3.26. Các mảnh mô ca cao dòng TD8. 78 Hình 3.27. Biến nạp gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8. 81 Hình 3.28. Biểu hiện gen gus/gusplus trên các mô ca cao chuyển gen 82 Hình 3.29. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các dòng ca cao chuyển gen. 84 Hình 3.30. Tái sinh cây từ phôi soma của dòng ca cao TD8 chuyển gen TcChi1 86 Hình 3.31. Các cây ca cao chuyển gen. 86 Hình 3.32. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các cây ca cao chuyển gen.. 87 Hình 3.33. Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn CaMV35S+TcChi1+cmyc+ KDEL+tNOS. 87 Hình 3.34. Vùng T-DNA của vector pCB301+TcChi1 89 Hình 3.35. Lai Southern các mẫu ca cao chuyển gen... 89 Hình 3.36. Quy trình chuyển gen vào cây ca cao. 90 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Nhân mô sẹo sơ cấp trên môi trường SCG... 52 Bảng 3.2. Nhân mô sẹo thứ cấp trên môi trường SCG..... 56 Bảng 3.3. Tỷ lệ phôi soma thứ cấp tạo chồi và ra rễ. 58 Bảng 3.4. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector biểu hiện thích hợp cho chuyển gen ca cao.. 79 Bảng 3.5. Lựa chọn thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen ca cao 80 Bảng 3.6. Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu ca cao biến nạp gen chỉ thị.. 82 Bảng 3.7. Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu ca cao TD8 biến nạp gen mã hóa chitinase. 85 ix DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy acetophenone) BAP 6-benzylaminopurin Bar Bialaphos resistance gene - Gen chịu thuốc trừ cỏ Bp Base pair - Cặp base CaMV Cauliflower mosaic virus - Virus khảm súp lơ DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DKW Driver and Kuniyuki medium - Môi trường DKW EDTA Ethylene diaminne tetra acetic acid EGFP Enhanced green fluorescent protein - Protein tăng cường phát huỳnh quang ED Embryo development medium - Môi trường cảm ứng tạo phôi EDL Embryo development in light medium - Môi trường chuyển dạng phôi và tạo cây gus β-1,4-glucuronidase LB Luria bertani - Môi trường LB nuôi vi khuẩn IM MS Induction medium - Môi trường cảm ứng Murashige and Skoog medium - Môi trường MS nptII Neomycin phosphotransferase II kb Kilobase OD Optical density - Mật độ quang PCG Primary callus growth medium - Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng dây chuyền polymerase PVPP Poly vinyl poly pyrolidone RNA Ribonucleotic acid x SCG Secondary callus growth medium - Môi trường nhân mô sẹo SD Standard deviation - Độ lệch chuẩn RD Root development and maintenance medium - Môi trường hình thành và phát triển rễ TDZ Thidiazuron YEP Yeast extract peptone - Môi trường YEP chứa cao nấm men và thịt bò X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Ca cao (Theobroma cacao L.) là một trong những cây kinh tế quan trọng, đem lại lợi nhuận đáng kể cho một số quốc gia trên thế giới. Bột ca cao được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm tại nhiều nước. Có nguồn gốc từ vùng Amazon (Nam Mỹ), cây ca cao phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, trong đó có Việt Nam. Hiện nay, cây ca cao đang được quan tâm để phát triển rộng rãi ở nước ta vì cây có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như triền dốc, đất cát, phù sa, đất nghèo dinh dưỡng. Ngoài ra, ca cao còn là cây chịu bóng mát tốt, nên có thể trồng xen canh với cây ăn trái, cây lâm nghiệp, phủ xanh đất tốt, thích hợp với kinh tế hộ gia đình và đặc biệt, thị trường tiêu thụ sản phẩm ca cao là rất lớn. Tuy nhiên, tương tự các loài cây trồng khác, phát triển sản xuất ca cao gặp nhiều khó khăn do giống bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng khác, kỹ thuật canh tác chưa hiệu quả, sâu và bệnh hại... Riêng bệnh nấm đã gây sụt giảm khoảng 30% sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới. Theo truyền thống, có rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng để phòng trừ bệnh hại với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng, cũng như môi trường. Để cải thiện tình hình, giúp cho cây ca cao phát triển bền vững, nhiều chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng chống chịu sâu bệnh và các tác nhân gây hại khác đã và đang được thực hiện với sự tham gia của nhiều tổ chức nghiên cứu và thương mại trên thế giới. Bên cạnh công tác chọn tạo giống theo phương pháp truyền thống, phương pháp chọn tạo giống ứng dụng công nghệ sinh học như tạo cây chuyển gen là một trong hướng nghiên cứu triển vọng trong việc tạo các giống ca cao có năng suất cao và chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường. Tại Việt Nam, nhiều dòng ca cao được cấp phép sử dụng rộng rãi được nhập nội và tuyển chọn từ Malaysia trong Chương trình do Hiệp hội Ca cao 2 Thế giới (The World Cocoa Foundation) hỗ trợ. Chính phủ và nhiều tổ chức quốc tế rất quan tâm phát triển cây ca cao nhằm đưa Việt Nam vào bản đồ ca cao thế giới, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao. Hiện nay chưa có nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen vào cây ca cao ở Việt Nam. Bên cạnh những thuận lợi và thành công đã đạt được trong lĩnh vực công nghệ sinh học, những khó khăn có thể gặp phải trong quá trình nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, trong đó có cây ca cao bằng công nghệ sinh học ở nước ta là không nhỏ. Trên cơ cở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đề tài đặt mục tiêu chung là xây dựng được quy trình tái sinh in vitro và tạo cây ca cao chuyển gen. Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro ở 1 - 2 dòng ca cao đang được canh tác ở Việt Nam; - Xây dựng được quy trình chuyển gen và tạo được cây ca cao chuyển gen chỉ thị gus/gusplus và gen kháng nấm. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh in vitro của 9 dòng ca cao đang được canh tác ở Việt Nam; - Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chitinase (TcChi1) từ cây ca cao ở Việt Nam và thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa chitinase; - Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam; - Nghiên cứu chuyển gen TcChi1 vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam và phân tích các dòng ca cao được chuyển gen. 4. Đóng góp mới của luận án - Lần đầu tiên ở Việt Nam, các dòng ca cao thương mại TD1, TD3, TD5, TD7, TD8, TD9 đã được tái sinh in vitro thành công; 3 - Gen mã hóa chitinase có hoạt tính kháng nấm đã được phân lập từ dòng ca cao hiện đang được canh tác tại Việt Nam và được chuyển vào vector biểu hiện thực vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen; - Gen chỉ thị gusplus và gen mã hóa chitinase đã được chuyển thành công vào dòng ca cao TD8 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng công nghệ tế bào thực vật và công nghệ gen trong việc nhân giống và chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây ca cao nói riêng, cải tiến giống và tăng khả năng chống chịu với các tác nhân gây bệnh. - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma của một số dòng ca cao hiện đang được canh tác ở Việt Nam. Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân nhanh các dòng ca cao mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ công tác chuyển gen. - Quy trình chuyển gen chỉ thị và gen đích vào cây ca cao thông qua A. tumefaciens là cơ sở khoa học để cải tiến giống ca cao thông qua công nghệ chuyển gen; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức năng gen ở cây trồng. - Kết quả phân lập gen mã hóa chitinase kháng nấm, thiết kế vec