Luận án Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí, tập san khoa học với sự đồng ý của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận án Bùi Kim Thúy 1 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, các nhà khoa học trong và ngoài nước. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Duy Lâm và PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm, những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Vụ Khoa học và công nghệ, Bộ Công Thương đã hỗ trợ một phần kinh phí để thực hiện đề tài nghiên cứu này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện thí nghiệm phục vụ luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tại Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchvà gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận án Bùi Kim Thúy 2 MỤC LỤC 3 KÍ HIỆU VIẾT TẮT AA : Axít ascorbic BZN : Benzoat natri CBTT : Chế biến tối thiểu CFU/ml : Colony Forming Unit Số đơn vị khuẩn lạc/ml mẫu CL : Canxi lactat FAO : Food and Agriculture Organization Tổ chức lương thực và nông nghiệp FDA : Food and Drug Administration Cục Quản lý thuốc và dược phẩm Hoa Kỳ GRAS : Generally Recognized as Safe Chứng nhận tuyệt đối an toàn HPLC : High Pressure Liquid Chromatography Sắc kí lỏng cao áp MAP : Modified Atmosphere Packaging Bao gói khí điều biến MIC : Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MRS : Man Rogosa Sharpe PDA : Potatoes Dextrose Agar PLA : Axít phenyllactic PPA : Axít phenylpyruvic PVC : Polyvinylchloride Màng nhựa dẻo TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TSS : Tổng số chất rắn hòa tan VKHKTS : Vi khuẩn hiếu khí tổng số NMNMT S : Nấm men, nấm mốc tổng số DANH MỤC BẢNG 4 5 DANH MỤC HÌNH 6 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Từ lâu, vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật được coi là an toàn (GRAS) và việc ứng dụng thành công nhóm vi khuẩn này hay những hợp chất kháng vi sinh vật mà chúng sản sinh ra trong bảo quản thực phẩm đã được đề cập nhiều. Một số loại chế phẩm sinh học đã được thử nghiệm và ứng dụng trong thực tiễn đem đến hiệu quả cao như bacterioxin và một số loại axít hữu cơ như axít lactic, axetic, xitric. Bacterioxin là các hợp chất có bản chất protein có khả năng ức chế vi sinh vật khá tốt được ứng dụng nhiều trong thực phẩm tuy phổ kháng vi sinh vật không rộng [35]. Trong khi đó, axít lactic, axít axetic và axít xitric lại có khả năng phòng trừ vi sinh vật tương đối yếu. Do vậy, những loại axít này thường được sử dụng kết hợp với những hợp chất khác để làm tăng hiệu quả. Gần đây, một hợp chất sinh học mới có tiềm năng ứng dụng như là chất bảo quản thực phẩm được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn lactic được các nhà khoa học thế giới phát hiện có tên là axít phenyllactic. So với nhiều loại bacterioxin sản sinh bởi vi khuẩn lactic như nisin thì axít phenyllactic có khối lượng phân tử thấp, phổ kháng vi sinh vật rộng và tính bền cũng như độ hòa tan cao [109]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng axít phenyllactic là một hợp chất an toàn, có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương và nấm men, nấm mốc, đặc biệt là nhiều loài nấm sinh độc tố [54][100] [110]. Trước những lợi ích cũng như tiềm năng đã được kiểm chứng thì axít phenyllactic là sản phẩm rất phù hợp sử dụng cho những đối tượng nông sản, thực phẩm dễ bị lây nhiễm bởi vi sinh vật gây hại và đòi hỏi có tính an toàn cao khi sử dụng. Rau quả chế biến tối thiểu (CBTT) là một trong những đối tượng nông sản đang được người tiêu dùng hướng tới hiện nay với tiêu chí đảm bảo độ tươi, ngon, tiện dụng và an toàn ít sử dụng hóa chất bảo quản nhất. Hơn nữa, rau quả chế biến thối thiểu là một dạng sơ chế, là những sản phẩm rau quả tươi đã thay đổi hình dạng ban đầu bằng một số tác động nhưng không bị xử lý nhiệt hay hóa chất đến mức chúng bị thay đổi trạng thái tươi sống. Rau quả tươi được chế biến tối thiểu thường phải qua các công đoạncơ bản mà không phải qua khâu nấu chín như xử lý cơ học (làm sạch, tách vỏ, cắt gọt, tạo hình,), ổn định sản phẩm (xử lý hóa học) và bao gói[80]. Nhược điểm lớn nhất của chế biến tối thiểu là thời hạn sử dụng sản phẩm bị giảm do khả năng bảo quản bị kém đi so với bảo quản các sản phẩm nguyên vẹn. Do rau quả CBTT bị loại bỏ lớp vỏ bảo vệ bên ngoài, làm kích hoạt các enzyme hoạt động tạo môi trường thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của các loài vi 7 sinh vật khác nhau nên đã làm thay đổi màu sắc, cấu trúc, mất trọng lượng dẫn tới tổn thất về cả số lượng và chất lượng trong quá trình bảo quản [78]. Vi sinh vật gây hại rau quả CBTT rất đa dạng về chủng loại và số lượng. Trong các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu người ta tìm thấy một số vi sinh vật phát triển mạnh như vi khuẩn ưa ẩm, vi khuẩn lactic, coliform, nấm men, nấm mốc, trong đó có nhiều loài có khả năng sinh độc tố mycotoxin [21]. Ngoài ra, những sản phẩm rau quảsẵn sàng để sử dụng vẫn còn bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh sau quá trình CBTT là một vấn đề tồn tại trong đảm bảo an toàn thực phẩm. Trong số đó, đáng kể đến là Listeria monocytogenes, Salmonella typhivà Escherichia coli, đặc biệt là E. coli O157: H7 [104]. Hạn chế tới mức thấp nhất vi sinh vật gây hại và ngăn chặn quá trình làm biến màu sản phẩm là những vấn đề cần được quan tâm và giải quyết trong CBTT. Những hợp chất hóa học thông thường được sử dụng cho mục đích này gồm clo, axít ascorbic, axít axetic, axít lactic và muối canxi (canxi lactat, canxi clorua) [45] [60]. Do khả năng ức chế vi sinh vật của những hợp chất này đối với rau quả cắt không cao nênmột số hợp chất hóa học khác được sử dụng kết hợp như 4- hexylresorcino, cysteine, benzoat natri, sorbat kali, để đem lại hiệu quả tốt hơn trong việc ngăn chặn biến màu, giảm thối hỏng do vi sinh vật gây ra và đảm bảo được độ cứng của sản phẩm [38]. Việc sử dụng những chất hóa học này đang ngày càng bị hạn chế bởi mong muốn của người tiêu dùng đang ngày càng ưa chuộng sử dụng những sản phẩm thực phẩm tươi và tự nhiên có tính an toàn cao không sử dụng chất bảo quản hoá học. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện nhằm tìm ra những hợp chất tự nhiên hay những chế phẩm sinh học để thay thế những chất hóa học có khả năng phòng trừ vi sinh vật gây hại trên rau quả chế biến tối thiểu [38]. Xu hướng sử dụng thực phẩm tươi và thực phẩm ít chế biếncủa người tiêu dùng hiện nay ngày càng tăng, hình thành nên một dạng thực phẩm mới là các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu. Rau quả CBTT hiệnlà một trong những mặt hàng hóa sôi động nhất trong các cửa hàng rau quả thực phẩm ở Mỹ. Thị trường rau quả cắt ở các nước Châu Á đã phát triển từ cuối những năm 80 và đầu những năm 90,đặc biệt là Nhật Bản và Hàn Quốc. Ở nhiều nước phát triển, việc sản xuất các sản phẩm rau quả tươi dạng CBTT đã trở thành một ngành công nghiệp có thị phần không nhỏ [47]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, CBTT gần đây mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu và thương mại. Dạng thực phẩm này tuy mới xuất hiện với số lượng hạn chế về chủng loại nhưng có tiềm năng phát triển mạnh mẽ vì phù hợp với xu thế phát triển kinh tế xã hội và lối sống hiện đại. Một số kết quả nghiên cứu bước đầu 8 về công nghệ CBTTcủa Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchđạt đượcmột số kết quả nhất định như đảm bảo được độ cứng, màu sắc của mít, dứa cắt mặc dù thời gian bảo quản còn ngắn (8-10 ngày) [2-4].Công nghệ CBTT ở Việt Nam hiện nay rất cần có hướng nghiên cứu sâu hơn, đa dạng hơn về chủng loại. Cho tới nay, những công trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic trên thế giới mới dừng ở phạm vi tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axít phenyllactic cao ứng dụng trực tiếp trong thực phẩm như bổ sung vào bột làm bánh hay bổ sung vào thức ăn chăn nuôi [99][105], chỉ có một vài nghiên cứu thử nghiệm sản xuất axít phenyllactic thông qua quá trình lên men ở quy mô nhỏ phòng thí nghiệm (3-10 lít) [69]. Do đó, việc “Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu”là thực sự cần thiết. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu tạoaxít phenyllactic từ vi khuẩn lactic và đánh giá được hiệu quả của axítphenyllactic trong việc duy trì chất lượng và đảm bảo an toàn thực phẩm đối với một số sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axít phenyllactic cao; - Tạo axít phenyllactic từ vi khuẩn tuyển chọn được bằng phương pháp lên men; - Đánh giá chất lượng của axít phenyllactic thu được; - Đánh giá hiệu quả của axít phenyllactic trong sơ chế, bảo quản một số rau (cà rốt, khoai tây) quả (dứa, mít, vải)chế biến tối thiểu. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học  Đã phân lập và tuyển chọn được bộ chủng giống vi khuẩn Lactobacillus plantarum có khả năng sinh axít phenyllactic cao.Kết quả này đã góp phần khai thác đa dạng vi sinh vật của Việt Nam cho ứng dụng trong công nghệ sinh học;  Là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống tổng thể về quá trình tạo axít phenyllactic, giải quyết trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu tạochế phẩm và cuối cùng là ứng dụng sản phẩm trên một số đối tượng rau quả CBTT. Đây là nguồn tài liệu đáng tin cậy để các nhà khoa học quan tâm đến các vấn đề tương tự tham khảo. 9 4.2. Ý nghĩa thực tiễn  Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm axít phenyllactic để có thể chủ động sản xuất chế phẩm đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước, đa dạng hóa sản phẩm bảo quản sinh học an toàn;  Đối tượng lựa chọn để ứng dụng chế phẩm tạo ra là rau quả chế biến tối thiểu. Đây là những sản phẩm rau quả ‘sẵn sàng để ăn’ và ‘sẵn sàng để nấu’ với yêu cầu phải đảm bảo chất lượng tươi, ngon và chứa những thành phần tự nhiên. Bởi vậy, việc ứng dụng chế phẩm PLA là chế phẩm bảo quản sinh học an toàn để bảo quản các sản phẩm CBTT có ý nghĩa thực tiễn cao;  Tạo ra cơ sở dữ liệu làm tài liệu tham khảo khi nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi sinh vật ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. 5. Điểm mới của luận án  Đã tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumC2 và C15 có khả năng sinh axít phenyllactic cao (hàm lượng đạt 1,2 g/l) với trình tự gen rADN 16S tương đồng 99% với trình tự gen của chủng Lactobacillus plantarum NRIC 1767. Hai chủng vi khuẩn này là hai chủng hoàn toàn mới so với các công trình đã công bố trước đây trong và ngoài nước.  Đã xây dựng được quy trình tạo axít phenyllactic bởi chủng L.plantarum C2 bằng phương pháp lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng quy mô 800 lít/mẻ hoàn chỉnh, là tiền đề tiến tới sản xuất chế phẩm quy mô công nghiệp;  Đã tạo ra được chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học và ứng dụng trong bảo quản rau quả chế biến tối thiểu, đây là điểm mới so với các công trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic khác trên thế giới; 6. Cấu trúc của luận án Luận án được trình bày trong 155 trang gồm 3 phần với 35 bảng, 53 hình và đồ thị.Phần 1. Tổng quan; Phần 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu; Phần 3. Kết quả và thảo luận; Phần 4. Kết luận và kiến nghị; Tài liệu tham khảo với 112 tài liệu tham khảo và Phần phụ lục.  10 CHƯƠNGI.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về axít phenyllactic 1.1.1. Đặc tính và tác dụng của axít phenyllactic Axít phenyllactic (PLA) là một loại axít thơm, có công thức phân tử là C9H10O3, trong phân tử có chứa vòng thơm (thể hiện ở hình 1.1). PLA dễ dàng hòa tan trong nước tạo thành dung dịch, nhiệt độ nóng chảy là 121-125ºC, khối lượng phân tử 166,2 [53]. Hình 1. 1. Cấu trúc phân tử của axít phenyllactic PLA đã được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triển của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men, nấm mốc gây hư hỏngthực phẩm [54][63][93]. PLA có thể gây ra những biến đổi về hoạt động và cấu trúc của vi khuẩn Listeria monocytogenes. Cơ chế tiêu diệt vi khuẩn là dưới sự hiện diện của PLA, vi khuẩn tập hợp thành khối, các polysaccarit được tách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, linh hoạt, bán thấm, làm cho tế bào trương nước, căng ra và kết quả là các tế bào vi khuẩn bị vỡ và tan rã [95]. Bên cạnh việc sử dụng PLA là chất kháng vi sinh vật trong nông sản và thực phẩm, gần đây PLA còn được sử dụng trong một số dược phẩm và mỹ phẩm [29][74]. Hơn nữa, PLA còn được chứng minh là có ảnh hưởng tốt đến hệ thống miễn dịch, khả năng đẻ trứng của gà. Tỷ lệ đẻ trứng của gà tăng lên, độ cứng của vỏ trứng cũng tăng khi bổ sung PLA vào khẩu phần ăn hàng ngày [105]. Một số nghiên cứu cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc với con người và động vật. PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượng cao và được đánh giá là rất an toàn với môi trường sống [109]. 11 Như vậy, axít phenyllactic được đánh giá là hợp chất an toàn có khả năng ức chế, kiểm soát tốt nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm nên rất có tiềm năng ứng dụng trong bảo quản nông sản và thực phẩm. Từ đó, việc nghiên cứu tạo ra chế phẩm axít phenyllactic tự nhiên an toàn để ứng dụng trong bảo quản là hướng đi mới và cần thiết hiện nay. 1.1.2. Cơ chế tổng hợp PLA PLA có thể được tạo ra bằng phương pháp hóa học và sinh học. PLA được tổng hợp bằng con đường hoá học thông qua quá trình khử của kẽm và axit hydrochloric và azlactone, hoặc quá trình hydro hoá dưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim của Pd-C.Bằng phương pháp này có thể sinh ra cả 2 dạng đồng phân là dạng D và dạng L. Tuy nhiên, việc sản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiện tiến hành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng tới môi trường sống [101]. Ngược lại, quá trình tổng hợp PLA bằng con đường sinh học có nhiều ưu điểm hơn. Sản xuất PLA theo phương pháp này chủ yếu sinh ra đồng phân dạng D là dạng có mặt trong cơ thể sống. Do vậy, PLA sản xuất theo phương pháp tổng hợp sinh học dễ dàng được người tiêu dùng chấp nhận [109]. Hình 1.2. Cơ chế sinh tổng hợp axít phenyllactic[68] Ở quá trình này, PLA được sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông qua quá trình lên men. PLA là sản phẩm cuối cùng của quá trình biến đổi phenylalanine, một trong số 20 axít amin thiết yếu sinh protein được mã hóa bởi AND (hình 1.2). 12 Trong quá trình biến đổi đó, ở điều kiện nhất định, phenylalanine chuyển hóa thànhaxít phenylpyruvic.Tiếp đến, sự hoạt hóa của enzym D-phenyllactic acid dehydrogenase, axít phenylpyruvic tiếp tục chuyển hóa thành axít phenyllactic [68]. Do đó, sản lượng PLA được tạo ra phụ thuộc rất nhiều chủng vi sinh vật sinh PLA và thành phần, điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật [69]. 1.1.3. Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA và các yếu tố ảnh hưởng 1.1.3.1. Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra được một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh PLA thông qua quá trình lên men trên môi trường đặc hiệu (bảng 1.1). Chủng nấm men Geotrichum candidumđược phát hiện lần đầu tiên là có khả năng sản sinh PLA trên môi trường lên men từ dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm men [36]. Nhiều nghiên cứu sau đó đã tìm ra được nhiều chủng vi khuẩn chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic, đặc biệt là chi Lactobacilluscó khả năng sinh PLA [97][100]. Trong số những chủng vi khuẩn có khả năng sinh PLA thuộc chi này thì loài Lactobacillus plantarum được phát hiện nhiều hơn cả [97][101][109]. Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men gluxit thành axít lactic. Tất cả những vi khuẩn lactic này đều có đặc điểm chung là: gram dương, bất động, không sinh bào tử, catalaza âm tính, nitratoreducaza âm tính, là vi khuẩn kị khí chịu khí, là loại cơ thể độc nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như kị khí. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau. Tế bào của chúng có thể là hình cầu như Streptoococcus hay Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. Người ta phân biệt chúng bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình[100]. Giống (chi) Lactobacillus là những vi khuẩn không sinh bào tử thuộc lớp vi khuẩn gram dương. Những trực khuẩn này đứng riêng lẻ hay thành chuỗi, thủy phân đường saccharoza mạnh, hình thành axít dạng D, L hay DL, không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, casein, indole và H2S. Chúng không có catalaza và cytochrome oxydaza. Chúng là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axít amin. Nhiều vi khuẩn thuộc nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh PLA như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis,...(bảng 1.1). 13 Bảng 1.1. Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axít phenyllactic [93] Chủng vi sinh vật Chất tạo thành Brevibacterium lactofermentum Axít phenyllactic Geotrichum candidum Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum 20B, Lactobacillus plantarum 21B Axít phenyllactic, 4-hydroxy- phenyllactic acid Lactobacillus plantarum MiLAB 393 3- Axít phenyllactic , cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro) Lactobacilluscoryniformis Si3,Lactobacillus sakei Peptide, Axít phenyllactic, cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro), reuterin Lactobacillus plantarum MiLAB 14 Hydroxy fatty acids, Axít phenyllactic , cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro) Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis, Leuconostoc citreum Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum FST1.7 Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum ITM21B Axít phenyllactic Lactobacillus sp SK007 Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum CRL778, Lactobacillus reuteri CRL1100, Lactobacillus brevis CRL772và CRL796 Axít phenyllactic, axít axetic Lactobacillus có khả năng sinh bacterioxin, PLA, axít 4-hydroxy phenyllactic và có khả năng sinh protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10 - 30 KDa [62]. 1.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Lactobacillus plantarum 14 Để tổng hợp và thu nhận PLA đạt hiệu suất cao nhất từ Lactobacillus plantarum, phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn với thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp thường được sử dụng. Thành phần môi trường là nhân tố quyết định tới quá trình sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus plantarum cũng như hiệu suất sinh PLA. Thành phần dinh dưỡng bao gồm các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng và các yếu tố môi trường như ảnh hưởng của pH, thời gian lên men, hàm lượng oxy. a. Ảnh hưởng của môi trườngnuôi cấy Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng khá phức tạp bởi khả năng tổng hợp hạn chế những yếu tố sinh trưởng của chúng như vitamin B và các axít amin. Chúng đòi hỏi một số nhân tố cho sinh trưởng như nguồn cacbon và nitơ ở dạng cacbohydrate, axít amin, vitamin và khoáng chất [53]. Một số yếu tố kích thích sinh trưởng cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ sản xuất axít phenyllactic. Hỗn hợp các axít amin, peptit luôn kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic và làm cho tỷ lệ phát triển cao hơn những chủng chỉ có axít amin tự do [100]. Axít béo cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và các muối phosphate là những muối quan trọng nhất trong quá trình lên men lactic. Ion ammonium không phải là ngu