Luận án Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ ANH THƢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUẾ, 2024 i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ ANH THƢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 Ngƣời hƣớng dẫn Khoa học: GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ, 2024 ii Lời Cảm Ơn Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận được rçt nhiều sự quan tåm, giúp đỡ của quý ban lãnh đäo, quý thæy cô giáo, quý đồng nghiệp và các anh chị học viên và sinh viên. Em xin chân thành câm ơn sự giúp đỡ quý giá đó. Đặc biệt, em xin bày tô lòng biết ơn chån thành và lời câm ơn såu sắc đến Thæy giáo GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc đã tận tình chỉ bâo và nhẫn näi với em trong suốt quá trình làm luận án, đã giúp đỡ em hoàn thành luận án này. Nếu không có sự giúp đỡ của thæy, thật sự em không thể có được như ngày hôm nay. Em xin câm ơn các thæy cô giáo täi bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đäi học Khoa học, Đäi học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài, đã động viên em chån thành và đæy cởi mở ngay từ những ngày đæu tiên. Em xin cám ơn phòng Đào täo Sau đäi học trường Đäi học Khoa học, Đäi học Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, täo mọi điều kiện tốt nhçt để em hoàn thành luận án này. Em muốn gửi lời câm ơn đến Thæy giáo TS. Nguyễn Minh Trí, Thæy đã giúp đỡ em rçt nhiều trong việc hoàn thành các thủ tục hồ sơ giçy tờ để em có thể bâo vệ thành công luận án. Em xin gửi lời câm ơn đến Ban Giám đốc, Ban Đào täo và Công tác Sinh viên Đäi học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Tổ chức Hành chính và Thanh tra Pháp chế, quý đồng nghiệp Khoa Cơ bân, Trường Đäi học Y - Dược, Đäi học Huế đã luôn täo những điều kiện tốt nhçt để em có điều kiện hoàn thành luận án này. Tôi xin chån thành cám ơn các bän học viên, sinh viên ngành Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ rçt nhiều trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của luận án, đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian làm luận án. Con xin gửi đến ba mẹ yêu quý của con những lời biết ơn chån thành nhçt. Cám ơn ba mẹ luôn ở bên cänh con để chia sẻ, động viên con trong những ngày con làm luận án. Cuối cùng xin gửi lời câm ơn đến người chồng yêu quý và hai con đã luôn bên cänh động viên, khuyến khích. Thật sự đåy là những động lực to lớn để tôi có thể đi đến thành công này. Một læn nữa xin câm ơn tçt câ với lòng biết ơn và chån thành nhçt! Thừa Thiên Huế, tháng 2 năm 2024 Nguyễn Thị Anh Thư iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Anh Thƣ iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AchE Acetylcholinesterase ADAM10 A Disintegrin and Metalloproteinase Protein 10 ADAM9 A Disintegrin and Metalloproteinase Protein 9 ATP Adenosine triphosphate ATPS Aqueous two-phase system Hệ hai pha nƣớc BDNF Brain-derived neurotrophic factor Yếu tố thần kinh nguồn gốc từ não BSA Bovine serum albumin cAMP Cyclic adenosine monophosphate CDS Coding Sequence cs Cộng sự ĐC Đối chứng DEAE Diethylaminoethyl DFP Diisopropyl fluorophosphate EDTA Ethylene diamine triacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật sinh hóa đƣợc dùng trong miễn dịch học GenBank Ngân hàng Gen GFP Green fluorescent protein HĐC Hoạt độ chung HĐR Hoạt độ riêng IGF-1 Insulin-like growth factor-1 Yếu tố tăng trƣởng giống Insulin-1 IPTG Isopropyl β-D-1- v thiogalactopyranoside JAK1 Janus kinase 1 KLPT Khối lƣợng phân tử LB Luria Bertani ORF Open reading frame PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PEG polyethylene glycol pI Điểm đẳng điện PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride PP Potassium phosphate RBS Ribosome binding site SBTI Self-Directed Biological Transformation Initiative SDS- PAGE Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Sec SRP Signal recognition particle STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1 TCA Trichloroacetic acid TGF-β Transforming growth factor beta uPA Urokinase-type plasminogen activator WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới YPD Yeast peptone dextrose Zymogram Điện di cơ chất vi MỤC LỤC Lời cảm ơn ................................................................................................................ ii LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... x MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE ............................................................................ 4 1.1.1. Đặc điểm của nattokinase ....................................................................... 4 1.1.2. Nguồn sản xuất nattokinase ....................................................................... 6 1.1.2.1. Vi khuẩn Bacillus ................................................................................ 6 1.1.2.2. Các nguồn sinh vật khác ................................................................... 11 1.1.3. Ứng dụng của nattokinase ....................................................................... 14 1.1.3.1. Ứng dụng trong chống đông máu ..................................................... 14 1.1.3.2. Các ứng dụng khác ............................................................................ 16 1.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Bacillus subtilis ............................................................... 18 1.2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................................ 18 1.2.2. Hệ thống vector biểu hiện ở Bacillus ...................................................... 19 1.2.3. Hệ thống tiết ở Bacillus ........................................................................... 20 1.3. ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG SẢN XUẤT ENZYME TÁI TỔ HỢP .. 23 1.3.1. Nattokinase .............................................................................................. 23 1.3.2. Các enzyme khác ..................................................................................... 25 1.4. TINH SẠCH ENZYME BẰNG HỆ 2 PHA NƢỚC ............................................... 27 1.4.1. Cấu tạo và đặc tính của hệ hai pha nƣớc ................................................. 28 1.4.2. Ứng dụng hệ hai pha trong tinh sạch enzyme ......................................... 31 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 37 vii 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 37 2.2.1. Phân lập gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis C10 và N05 .. 37 2.2.2. Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong tế bào E. coli TOP10 ............... 38 2.2.3. Biến nạp vector pHT43/nat05 và pHT43/natC10 vào Bacillus subtilis BD170 ................................................................................................................ 40 2.2.4. Biểu hiện nattokinase bằng hệ thống vector pHT43 ................................ 41 2.2.5. Xác định hoạt tính nattokinase ................................................................ 43 2.2.6. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin ................... 44 2.2.7. Thử nghiệm khả năng phân giải fibrin trong máu thỏ bằng nattokinase tái tổ hợp ................................................................................................................. 45 2.2.8. Tinh sạch nattokinase tái tổ hợp bằng hệ hai pha nƣớc ........................... 45 2.3. XỬ LÝ THỐNG KÊ ...................................................................................... 47 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 48 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis.48 3.1.1. Khuếch đại gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis .................. 48 3.1.2. Tạo dòng gen nattokinase giả định trong vector pCR®2.1 ...................... 49 3.1.3. Xác định trình tự gen nattokinase giả định từ các chủng B. subtilis ....... 51 3.2. TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG Bacillus subtilis BD170 ............... 54 3.2.1. Tạo dòng gen nat05 và natC10 vào vector pHT43 ................................. 54 3.2.2. Biến nạp vector pHT43 tái tổ hợp vào B. subtilis BD170 ....................... 56 3.3. BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRONG Bacillus subtilis BD170 . 57 3.3.1. Xác định dòng B. subtilis BD170 biểu hiện nattokinase mạnh ............... 57 3.3.2. Đặc điểm của nattokinase tái tổ hợp ở dòng R4 ...................................... 59 3.4. TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƢỚC ............................. 63 3.4.1. Ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử PEG ................................................ 63 3.4.2. Ảnh hƣởng của nồng độ potassium phosphate ........................................ 65 3.4.3. Thu hồi enzyme ....................................................................................... 66 viii 3.4.4. Xác định khối lƣợng phân tử của nattokinase tái tổ hợp ......................... 67 Chƣơng 4. THẢO LUẬN ........................................................................................ 69 4.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis .................................................................................................................................. 69 4.2. TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG VECTOR BIỂU HIỆN pHT43 70 4.3. BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP Ở Bacilus subtilis ........................... 71 4.3.1. Biểu hiện gen mã hóa nattokinase ........................................................... 71 4.3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin ................... 74 4.3.3. Thử nghiệm khả năng phân giải cơ chất của nattokinase ........................ 77 4.4. TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƢỚC ............................. 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 81 1. KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 81 2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 81 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................. 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 83 ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số chủng vi khuẩn Bacillus sản xuất đƣợc phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống ............................................................................... 6 Bảng 1.2. Nguồn sinh vật sản xuất enzyme thủy phân fibrin. ............................... 11 Bảng 2.1. Trình tự các primer dùng để khuếch đại PCR gen nattokinase từ B. subtilis C10 và N05 ............................................................................... 38 Bảng 3.1. Hoạt độ protease của các dòng B. subtilis BD170 tái tổ hợp ................ 58 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính nattokinase của Nat05 ............... 60 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính nattokinase của Nat05 ....................... 61 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các ion kim loại và chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính nattokinase của Nat05............................................................................ 62 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của PEG 2000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase. .. 64 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của PEG 6000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase. .. 64 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của PEG 10000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase . 65 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của PP 15% đến sự phân tách nattokinase ......................... 65 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của PP 25% đến sự phân tách nattokinase ......................... 66 Bảng 3.10. Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzyme khi sử dụng hệ hai pha nƣớc của B. subtilis BD170 tái tổ hợp ............................................................ 67 x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian 3 chiều của nattokiase ............................................ 5 Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của nattokinase trong chống đông máu. ................... 14 Hình 1.3. Hình ảnh kính hiển vi điện tự quét tế bào B. subtilis 168. .................... 19 Hình 1.4. Sơ đồ biểu diễn hệ thống mạng lƣới các con đƣờng tiết protein của B. subtilis. ................................................................................................... 21 Hình 1.5. Sơ đồ mô tả hệ thống tiết protein theo con đƣờng Sec và các thành phần tham gia ở B. subtilis.. ........................................................................... 23 Hình 1.6. Sơ đồ phân tách quá trình chuyển hóa sinh học bằng hệ hai pha .......... 28 Hình 1.7. Các giai đoạn phân tách và tinh sạch enzyme bằng hệ hai pha PEG/muối. ............................................................................................. 30 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tách nattokinase bằng hệ 2 pha. .............. 47 Hình 3.1. Khuếch đại PCR với cặp mồi NatF và NatR từ DNA tổng số.. ............ 48 Hình 3.2. Tinh sạch sản phẩm PCR.. ................................................................... 49 Hình 3.3. Kiểm tra khuẩn lạc mang sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu. .......... 50 Hình 3.4. Sơ đồ vector pCR®2.1 mang gen mã hóa nattokinase. .......................... 50 Hình 3.5. So sánh trình tự của các gen nat05 và natC10 phân lập đƣợc với trình tự gen aprN từ chủng B. subtilis MTCC 7164 ........................................... 53 Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các gen phân lập đƣợc với trình tự nattokinase từ chủng B. subtilis MTCC 7164 . ........................ 54 Hình 3.7. Kiểm tra sự hiện diện gen mã hóa nattokinase trong vector pHT43 ở chủng vi khuẩn E. coli TOP10 bằng phản ứng PCR. ............................ 55 Hình 3.8. Sơ đồ vector pHT43 mang gen mã hóa nattokinase.. ............................ 55 Hình 3.9. Kiểm tra sự hiện diện của vector pHT43 tái tổ hợp trong B. subtilis BD170 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.. .............................. 56 Hình 3.10. Vòng phân giải sữa tách béo của các dòng B. subtilis BD170 tái tổ hợp khi cảm ứng IPTG ở nồng độ 1 mM. .................................................... 57 xi Hình 3.11. Vòng phân giải fibrinogen của dòng R4 khi đƣợc cảm ứng với IPTG ở các nồng độ khác nhau (1-5 mM). ................................................................. 58 Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE (A) và điện di cơ chất (B) của dịch enzyme ngoại bào.. ....................................................................................................... 59 Hình 3.13. Thử nghiệm khả năng phân giải cục máu đông thỏ bằng enzyme tái tổ hợp. ........................................................................................................ 62 Hình 3.14. Điện di sản phẩm tinh sạch trên polyacrylamide gel 12%. ................... 68 Hình 3.15. Điện di sản phẩm tinh sạch trên polyacrylamide gel có bổ sung cơ chất. ... 68 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhồi máu cơ tim và các bệnh tim mạch là những bệnh rất nghiêm trọng, ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời và là nguyên nhân chính gây đột tử ở ngƣời. Theo thống kê của WHO, khoảng 17,7 triệu ngƣời chết mỗi năm trên thế giới liên quan đến bệnh tim mạch, trong đó chủ yếu bệnh thiếu máu cục bộ, cao huyết áp và các bệnh mạch máu não. Nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu, tắc nghẽn phổi, cục máu đông tĩnh mạch là các chứng bệnh do rối loạn đông máu gây ra. Ở ngƣời bình thƣờng, sự tích tụ fibrin và phân hủy fibrin trong máu đƣợc duy trì cân bằng, tuy nhiên khi fibrin không bị phân hủy gây nên sự mất cân bằng, dẫn đến nhồi máu cơ tim và các rối loạn đông máu khác. Khi đó, máu đông sẽ hình thành trong thành mạch [119]. Phân giải fibrin đóng vai trò quan trọng trong liệu pháp điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu. Do bản chất fibrin là các protein nên chúng sẽ bị phân hủy bằng protease. Các protease thƣờng đƣợc sử dụng trong điều trị gồm có nattokinase, urokinase, streptokinase và plasmin. Urokinase và plasmin luôn hiện diện trong cơ thể ngƣời nhƣng sự tích lũy plasmin có thể gây ra hiện tƣợng xuất huyết trong. Streptokinase có nguồn gốc từ vi sinh vật, có giá thành sản xuất rẻ, tuy nhiên gây ra đáp ứng miễn dịch khi đƣa vào cơ thể, tạo ra hiệu ứng không mong muốn nhƣ xuất huyết trong và dị ứng. Hiện nay, nattokinase là liệu pháp chính đƣợc sử dụng để chống lại các bệnh máu đông [91, 99]. Natto là một sản phẩm lên men từ đậu nành đƣợc ngƣời Nhật sử dụng trên 2000 năm nhƣ thuốc tự nhiên phòng và trị các bệnh tim mạch. Thành phần chính của Natto là nattokinase, đây là một serine protease [102]. Nattokinase phân hủy máu đông trực tiếp thông qua thủy phân sợi fibrin và cơ chất plasmin, chuyển đổi prourokinase nội sinh đến urokinase, phân hủy tác nhân ức chế lên plasminogen và tăng mức độ hoạt hóa plasminogen ở mô qua đó tăng cƣờng hoạt tính thủy phân fibrin [119, 126]. Ngoài ƣu điểm ít tác dụng phụ lên mạch máu, nattokinase dễ dàng đƣợc hấp thụ qua đƣờng ruột và có hoạt tính rất mạnh sau khi hấp thụ trong tá tràng. 2 Những ƣu điểm này giúp nattokinase dễ sử dụng và hoạt tính thủy phân fibrin có thể áp dụng chống lại bệnh máu đông [35, 45]. Ngoài ra, nattokinae còn đƣợc sử dụng trong điều trị huyết áp [28] hay đƣợc sử dụng trong nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer [31]. Công nghệ DNA tái tổ hợp đã góp phần tạo ra một lƣợng lớn enzyme công nghiệp nhƣ protease, amylase, và lipase từ vi khuẩn Gram dƣơng và nấm. Bacillus là một trong những nhóm vi sinh vật đƣợc ứng dụng nhiều nhất để sản xuất enzyme, phụ gia thực phẩm, vitamin, kháng sinh và thuốc diệt côn trùng. Bên cạnh ƣu điểm sản xuất protein ngoại bào mạnh, vi khuẩn thuộc chi Bacillus còn sử dụng sản xuất các protein tái tổ hợp không glycosyl hóa do đặc tính di truyền của chúng đƣợc nghiên cứu rất kỹ và dễ dàng kiểm soát quá trình sinh tổng hợp thông qua các kỹ thuật di truyền [29]. Bên cạnh đó, trình tự tín hiệu peptide của chúng có thể đƣợc sử dụng trong sản xuất các protein dung hợp. Đặc biệt, các trình tự tín hiệu peptide dễ dàng đƣợc tối ƣu cho từng loại protein đích, vì vậy tăng cƣờng đáng kể hiệu quả sản xuất ngoại bào các protein tái tổ hợp [15]. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng và tối ƣu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp” nhằm mục đích cung cấp nguồn dƣợc chất tự nhiên cho các ứng dụng trong lĩnh vực y dƣợc học. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tạo dòng gen mã hóa nattokina