Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây dây thìa canh (gymnema sylvestre (retz.) r. br. ex schult.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HOÀNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HOÀNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Văn Ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Văn Ơn và PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu. Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Luận án NCS. Hoàng Minh Châu LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các tập thể thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn và PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Dược liệu, các thầy cô trong Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và hàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: - GS Oh Wen Keun, Khoa Dược, trường ĐH Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc - Thạc sỹ Phạm Hà Thanh Tùng, Giáo viên bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, Nghiên cứu sinh tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc. - GS.TS Nguyễn Thanh Kỳ, nguyên Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà Nội - PGS.TS Đỗ Thị Hà, phó trưởng khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu. - PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, trưởng Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội. Đã tạo điều kiện giúp đỡ,hướng dẫn và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn thiện Luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, đến những người đồng nghiệp trong công ty Nam Dược đã luôn ủng hộ, gánh vác công việc và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. NCS. Hoàng Minh Châu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic ALP : Alkaline Phosphatase ALAT : Chỉ số men gan ASAT : Chỉ số men gan ARN : Acid ribonucleic AUC : Diện tích dƣới đƣờng cong (Area under the curve) COSY : Phổ Cosy (Correlation Spectroscopy) DMSO : Dimethyl sulfoxid DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's medium DTT : Dithiothreitol DTC : Dây thìa canh Gymnema sylvestre ĐTĐ : Đái tháo đƣờng EA : Ethyl acetat EDTA : Acid ethylene diamin tetraacetic ESI- MS : Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) EtOH : Ethanol GAPDH : Glyceraldehyd 3- phosphate dehydrogenase GACP – WHO : Thực hành trồng trọt, thu hái, chế biến tốt dƣợc liệu theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới G.albiflorum : Gymnema albiflorum G. alterfolium : Gymnema alterfolium G.griffithii : Gymnema griffithii G. hirsutum : Gymnema hirsutum G. inodorum : Gymnema inodorum G.latifolium : Gymnema latifolium G.sylvestre : Gymnema sylvestre G.yunnansense : Gymnema yunnansense G. montanum : Gynema montanum Gla : Acid glucuronic Glc : Glucose GM : Gymnemagenin GS : Gymnema sylvestre GS3 : Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh GS4 : Một phân đoạn chiết xuất của Dây thìa canh G3PDH : Glycerol - 3- phosphate dehydrogenase HBA1C : Chỉ số gắn kết của đƣờng trên hemoglobin hồng cầu HDL : High density lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao HE x 400 : Nhuộm Hematoxylin – Eosin, độ phóng đại 400 lần HFD : Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) HMBC : Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High- performance liquid chromatography) HRESI MS : Phổ khối lƣợng phun mù điện tử phân giải cao (High resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) HSQC : Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua 1 liên kết (Heteronuclear Single Quantum Connectivity) IR : Insulin receptor MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol NFD : Chế độ ăn bình thƣờng (Nomal fat diet) NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance Spectrometry) NOESY : Phổ Noesy (Nuclear Overhause Effect Spectroscopy) NP : Pha thƣờng (Normal phase) LDL : Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng thấp LOL : Giới hạn tuyến tính ( Limit of Linear) LOD : Giới hạn phát hiện ( Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lƣợng ( Limit of Qualification) OA : Acid oleanolic OVL : Chồng lấn (Overlap) PBS : Phosphate buffered saline PTP1B : Protein tyrosine phosphatases p-NPP : p-nitrophenyl phosphate RP : Pha đảo (Reverse phase) SD : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) STZ : Streptozocin TG : Triglycerid TLC : Sắc ký lớp mỏng TLTK : Tài liệu tham khảo UA : Acid ursolic Xyl : Xylose 1 H NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry) 2-NBDG : Glucose fluorescent 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol- 4- yl)Amino)-2-Deoxyglucose 2D-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimension Nuclear magnetic resonance Spectrometry) 13 C -NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br trên thế giới 4 Bảng 1.2. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam 6 Bảng 1.3. Các hợp chất saponin có khung olean trong DTC G. sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult 10 Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học các hợp chất alternosid phân lập từ G.alternifolium (Lour.) Merr 16 Bảng 1.5. Cấu trúc hóa học một số saponin khung olean của Gymnema inodorum (Lour.) Decne 17 Bảng 1.6. Một số hợp chất saponin khung dammaran phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult 19 Bảng 1.7. Tổng hợp một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br Gymnema R.Br 26 Bảng 1.8. Hàm lƣợng Gymnemagenin các mẫu DTC thu theo tháng với các cách làm khô khác nhau 30 Bảng 2.1. Thời gian thu mẫu DTC G.sylvestre R. Br. ex Schult 33 Bảng 2.2. Chế độ ăn NFD và HFD tính trên 100g thức ăn 40 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của chất 1 49 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của chất 2 53 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của chất 3 57 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của chất 4 59 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR chất 5 63 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của các chất 6,7 67 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của các chất 8 72 Bảng 3.8. Sự biến đổi nồng độ glucose máu của chuột sau 8 tuần ăn thức ăn giàu chất béo 77 Bảng 3.9. Vi thể tụy của chuột sau 2 tuần uống mẫu 80 Bảng 3.10. Hoạt tính ức chế enzyme PTP1B của các chất 1-8 86 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của TCNH, aglycon chất 5 và gymnemagenol tham khảo 93 Bảng 3.12. Tính thích hợp của của hệ thống 101 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu chất đối chiếu 101 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu thực 102 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp 102 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính đúng của phƣơng pháp 103 Bảng 3.17. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp 105 Bảng 3.18. Hàm lƣợng gymnemagenol các mẫu dịch chiết thuỷ phân DTC theo các tháng 105 Bảng 4.1. Danh sách các chất phân lập từ Dây thìa canh 111 Bảng 4.2. Sinh khối DTC vùng trồng Nam Định tại các thời điểm thu hoạch 120 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc khung olean của các hợp chất trong G. sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult 8 Hình 1.2. Cấu trúc các nhóm thế của hợp chất saponin khung olean trong Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult 9 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học chung của các alternosid phân lập từ loài G.alternifolium (Lour.) Merr 15 Hình 1.4. Cấu trúc các nhóm thế trong các hợp chất alternosid phân lập từ G. Alternifolium (Lour.) Merr 16 Hình 1.5. Cấu trúc của một số hợp chất saponin có khung olean phân lập từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne 17 Hình 1.6. Cấu tạo của gymnemasid VI và gymnemasid VII 18 Hình 1.7. Cấu tạo chung của các gymnemasid I-V 18 Hình 1.8. Cấu trúc các nhóm thế trong các gymnemasid phân lập từ G. sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult 19 Hình 1.9. Sự thay đổi hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Re và Ro trong rễ nhân sâm theo tuổi thu hái 30 Hình 1.10. Hàm lƣợng gymnemic acid II tại tại các bộ phận của Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult 31 Hình 2.1. Lá và hoa cây Dây thìa canh tại vùng trồng Hải Hậu, Nam Định 34 Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu trên chuột nhắt ĐTĐ typ 2 41 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất, phân lập các chất từ Dây thìa canh 47 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học chất 1 49 Hình 3.3. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) trong chất 1 51 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học chất 2 53 Hình 3.5. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 2 55 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học chất 3 56 Hình 3.7. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 3 56 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học chất 4 59 Hình 3.9. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) trong chất 4 62 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học chất 5 62 Hình 3.11. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 5 63 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học chất 6 66 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học chất 7 66 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học chất 8 71 Hình 3.15. Các tƣơng tác HMBC (H C) và COSY (H-H) của chất 8 72 Hình 3.16. Sự thay đổi khối lƣợng chuột tại các thời điểm nghiên cứu 76 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của mẫu thử lên nồng độ glucose máu của chuột nhắt trắng ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần uống mẫu thử 78 Hình 3.18. Trọng lƣợng gan tƣơng đối của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần điều trị 79 Hình 3.19. Trọng lƣợng tụy của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần điều trị 80 Hình 3.20. Hình thái vi thể tụy chuột lô chứng (chuột số 2) (HE x 400) 82 Hình 3.21. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình (chuột số 18) (HE x 400) 82 Hình 3.22. Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình (chuột số 21) (HE x 400) 83 Hình 3.23. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột số 27) (HE x 400) 83 Hình 3.24. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột số 29) (HE x 400) 84 Hình 3.25. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 78) (HE x 400) 84 Hình 3.26. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 79) (HE x 400) 85 Hình 3.27. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 71) (HE x 400) 85 Hình 3.28. Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 74) (HE x 400) 86 Hình 3.29. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của chất 5 trên enzyme PTP1B 87 Hình 3.30. Ảnh hƣởng của các chất 1-5 trên khả năng hấp thu glucose fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 88 Hình 3.31. A. Ảnh hƣởng của chất 5 trên khả năng hấp thu glucose fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1; B. Ảnh hƣởng của chất 5 ở điều kiện nồng độ khác nhau trên khả năng hấp thu glucose fluorescent 2-NBDG vào trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 88 Hình 3.32. Cấu trúc của gymnemagenol 90 Hình 3.33. Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) của TCNH 97 Hình 3.34. So sánh phổ của chất 4 có CH2OH-29 và chất tham khảo có cấu hình CH2OH-29𝛽 98 Hình 3.35. Cấu trúc của TCNH 99 Hình 3.36. Sắc ký đồ của chất đối chiếu gymnemagenol và các mẫu thử 100 Hình 3.37. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng gymnemagenol 103 Hình 3.38. Dãy nồng đồ xác định giới hạn tuyến tính của phƣơng pháp 104 Hình 3.39. Tỷ lệ % gymnemagenol trong các mẫu dịch chiết thuỷ phân theo các tháng 107 Hình 4.1. Mẫu DTC lƣu giữ tại Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Paris, Pháp 109 Hình 4.2. Cơ chế giảm tác dụng kháng insulin của chất ức chế enzym PTP1B 117 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1. THỰC VẬT HỌC ........................................................................................... 3 1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br. ............ 3 1.2. Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài ................ 6 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R. Br. .................................................................................................... 7 2.1. Nhóm hợp chất saponin ................................................................................. 7 2.2. Các nhóm chất khác .................................................................................... 19 3. TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID HUYẾT CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R. Br ..................................... 20 3.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết ............................................................................ 20 3.2. Tác dụng chống tăng lipid huyết ................................................................. 25 4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƢỢC LIỆU ....................................................... 28 4.1. Phƣơng pháp định lƣợng và đánh giá động thái tích lũy hoạt chất .................. 28 4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi cây ........................................................... 28 4.3. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái trong năm. .......................... 29 4.4. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trƣởng và bộ phận của cây. ... 30 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 33 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................... 33 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................. 33 2.1.2. Vật liệu, dung môi, hóa chất .......................................................................... 34 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ................................................... 35 2.1.4. Động vật thực nghiệm dùng trong nghiên cứu .............................................. 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 38 2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học ..................................................................... 38 2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập ............................................... 38 2.2.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học ........................................................................ 38 2.2.2.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đƣờng huyết ............................................................................................................................. 39 2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột của dịch chiết Dây thìa canh .............................................................................................................................. 39 2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập đƣợc ............. 41 2.2.2.3.1. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế enzym PTP1B của hoạt chất. ... 41 2.2.2.3.2. Phƣơng pháp biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1 .......................................... 42 2.2.2.3.3. Phƣơng pháp đo độ hấp thu glucose trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các chất phân lập. ............................................................................................................... 43 2.2.2.3.2.4. Phƣơng pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang ................................. 43 2.2.2.3.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả ................................................................ 43 2.2.3. Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất trong lá Dây thìa canh ................... 44 2.2.3.1. Phƣơng pháp thủy phân và xác định cấu trúc aglycon ............................... 44 2.2.3.2.Phƣơng pháp định lƣợng aglycon và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 46 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ...................... 46 3.1.1. Chiết xuất và phân lập các chất tinh khiết từ Dây thìa canh .......................... 46 3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập đƣợc ................................... 48 3.1.2.1. Chất 1 .......................................................................................................... 48 3.1.2.2. Chất 2 .......................................................................................................... 52 3.1.2.3. Chất 3 .......................................................................................................... 55 3.1.2.4. Chất 4 .......................................................................................................... 58 3.1.2.5. Chất 5 .......................................................................................................... 61 3.1.2.6. Chất 6 .......................................................................................................... 65 3.1.2.7. Chất 7 .......................................................................................................... 66 3.1.2.8. Chất 8 .......................................................................................................... 69 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ......................... 74 3.2.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột ............................ 74 3.2.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập ......... 85 3.3.2.1.Hoạt tính ức chế enzym PTP1B ................................................................... 85 3.2.2.2.Hoạt tính hấp thu glucose trong tế bào 3T3-L1 của các chất ...................... 86 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT ....... 88 3.3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon gymnemagenol ............... 88 3.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng gymnemagenol và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất trong DTC. .............................................................................................. 96 3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu và khảo sát điều kiện phân tích ........................... 96 3.3.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống .......................................................... 98 3.3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp ........................................................................ 98 3.3.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp ............................................ 99 3.3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp ........................................................................ 100 3.3.2.6. Giới hạn của phƣơng pháp ........................................................................ 101 3.3.2.7. Định lƣợng gymnemagenol các mẫu Dây thìa canh theo các tháng thu hái102 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 106 4.1. VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 106 4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................ 107 4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ..................................................................... 112 4.3.1. Về tác dụng