Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của loài xáo leo (paramignya scandens (griff.) craib) ở Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VN VIỆN HÓA SINH BIỂN NGUYỄN THỊ DIỆU THUẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI XÁO LEO (PARAMIGNYA SCANDENS (GRIFF.) CRAIB) Ở LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VN VIỆN HÓA SINH BIỂN NGUYỄN THỊ DIỆU THUẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI XÁO LEO (PARAMIGNYA SCANDENS (GRIFF.) CRAIB) Ở LÂM ĐỒNG CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC HỮU CƠ MÃ SỐ: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học 1: GS.VS. Châu Văn Minh Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Hữu Toàn Phan HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.VS. Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Hữu Toàn Phan - những người Thầy đã dành cho tôi sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức nhiệt tình của: - Các Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Ban Chủ nhiệm Chương trình Khoa học và Công nghệ phục vụ phát triển Kinh tế - Xã hội vùng Tây Nguyên và Chủ nhiệm đề tài TN3/T14. Tôi xin chân thành cám ơn những sự giúp đỡ quý báu đó! Nguyễn Thị Diệu Thuần LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Diệu Thuần MỤC LỤC Trang Lời cám ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ảnh, đồ thị MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Nguồn tài nguyên dược liệu tại Lâm Đồng .............................................................. 3 1.1.1. Khái quát về tiềm năng cây thuốc của Lâm Đồng ......................................... 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở Việt Nam của một số loài thực vật tương tự tại Lâm Đồng ..................................... 5 1.1.3. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của một số loài thực vật (tương tự loài ở Lâm Đồng) ................................................................ 7 1.2. Giới thiệu chung về chi Paramignya (Rutaceae): .................................................... 8 1.2.1 Đặc điểm sinh học của chi Paramignya (Rutaceae): ...................................... 8 1.2.2 Hoạt tính sinh học của chi Paramignya (Rutaceae): .................................... 11 1.2.2.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoit ....................................... 11 1.2.2.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất coumarin ...................................... 14 1.2.2.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất triterpen dạng khung tirucallan ... 15 1.2.2.4. Hoạt tính sinh học của chi Paramignya ................................................ 16 1.3. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paramignya (Rutaceae) ..................... 18 1.3.1. Tổng quan các kết quả trong và ngoài nước ................................................ 18 1.3.1.1. Các công trình đã công bố trên thế giới ................................................ 18 1.3.1.2. Các công trình đã công bố trong nước: ................................................. 21 1.4. Các hợp chất Tirucallan .......................................................................................... 23 1.4.1. Phổ 1H-NMR của các hợp chất tirucallan .................................................... 24 1.4.2. Phổ 13C-NMR của các hợp chất tirucallan ................................................... 27 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 28 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ....................................................................... 28 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ............................................................................... 28 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ............................................................................ 29 2.2.3. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................ 29 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ......................................................... 29 2.3.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV) ....................................................... 29 2.3.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 29 2.3.3. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................ 30 2.3.4. Phương pháp khối phổ (MS) ........................................................................ 30 2.3.5. Thiết bị phân tích ......................................................................................... 31 2.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào................................................. 31 2.4.1. Mục tiêu và cơ sở lý thuyết .......................................................................... 31 2.4.2. Vật liệu ......................................................................................................... 32 2.4.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 32 2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kích hoạt enzym caspase 3/7 .............................. 34 2.6. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm: ................................................................ 35 2.6.1. Nuôi cấy tế bào ............................................................................................ 35 2.6.2. Đo Cytokine ................................................................................................. 35 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 36 3.1. Điều chế các dịch chiết từ Paramignya scandens: ................................................. 36 3.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học dịch chiết ............................................................... 37 3.3. Nghiên cứu hóa học cây P. scandens ..................................................................... 37 3.3.1. Quy trình phân lập ........................................................................................ 37 3.3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được: ................. 40 3.3.2.1. Hợp chất 01 (PS16): Paramignyol A (Chất mới) .................................. 40 3.3.2.2. Hợp chất 02 (PS15): Paramignyol B (Chất mới) .................................. 40 3.3.2.3. Hợp chất 03 (PS31): Paramignyoside A (Chất mới) ............................. 41 3.3.2.4. Hợp chất 04 (PS32): Paramignyoside B (Chất mới) ............................. 42 3.3.2.5. Hợp chất 05 (PS28): Paramignyoside C (Chất mới) ............................. 43 3.3.2.6. Hợp chất 06 (PS30): Paramignyoside D (Chất mới) ............................. 44 3.3.2.7. Hợp chất 07 (PS29): Paramignyoside E (Chất mới) ............................. 45 3.3.2.8. Hợp chất 08 (PS01): Methyl isolimonate .............................................. 46 3.3.2.9. Hợp chất 09 (PS02): (6R,9S)-roseoside ................................................ 46 3.3.2.10. Hợp chất 10 (PS03): -D-glucopyranoside methyl salicylate............. 47 3.3.2.11. Hợp chất 11 (PS05): Adenosine .......................................................... 47 3.3.2.12. Hợp chất 12 (PS09): 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D- glucopyranoside .................................................................................................. 47 3.3.2.13. Hợp chất 13 (PS10): Syrigin ............................................................... 48 3.3.2.14. Hợp chất 14 (PS13): Atripliside B ...................................................... 48 3.3.2.15. Hợp chất 15 (PS18): trans-N-p-coumaroyl tyramine.......................... 49 3.3.2.16. Hợp chất 16 (PS20): 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O-- L-rhamno- pyranosyl-(16)--D-glucopyranoside .......................................... 49 3.3.2.17. Hợp chất 17 (PS21): Gusanlungionoside C ........................................ 50 3.3.2.18. Hợp chất 18 (PS23): Betulalbuside B ................................................. 50 3.3.2.19. Hợp chất 19 (PS25): Syringaresinol di-O--D-glucopyranoside ........ 51 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 52 4.1. Quy trình phân lập .................................................................................................. 52 4.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất ........................................................................ 54 4.2.1. Hợp chất 01: Paramignyol A (Chất mới) ..................................................... 54 4.2.2. Hợp chất 02: Paramignyol B (Chất mới) ..................................................... 59 4.2.3. Hợp chất 03: Paramignyoside A (Chất mới) ................................................ 63 4.2.4. Hợp chất 04: Paramignyoside B (Chất mới) ................................................ 69 4.2.5. Hợp chất 05: Paramignyoside C (Chất mới) ................................................ 72 4.2.6. Hợp chất 06: Paramignyoside D (Chất mới) ................................................ 75 4.2.7. Hợp chất 07: Paramignyoside E (Chất mới) ................................................ 79 4.2.8. Hợp chất 08: Methyl isolimonate ................................................................. 82 4.2.9. Hợp chất 09: (6R,9S)-roseoside ................................................................... 86 4.2.10. Hợp chất 10: -D-glucopyranoside methyl salicylate ............................... 89 4.2.11. Hợp chất 11: Adenosine ............................................................................. 91 4.2.12. Hợp chất 12: 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-glucopyranoside ........... 93 4.2.13. Hợp chất 13: Syrigin .................................................................................. 95 4.2.14. Hợp chất 14: Atripliside B ......................................................................... 97 4.2.15. Hợp chất 15: trans-N-p-coumaroyl tyramine .......................................... 100 4.2.16. Hợp chất 16: 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L- rhamnopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside .................................................. 102 4.2.17. Hợp chất 17: Gusanlungionoside C ......................................................... 105 4.2.18. Hợp chất 18: Betulalbuside B .................................................................. 108 4.2.19. Hợp chất 19: syringaresinol di-O--D-glucopyranoside ......................... 111 4.3. Kết quả thử hoạt tính ............................................................................................ 114 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................................ 114 4.3.2. Hoạt tính kháng viêm ................................................................................. 117 4.4. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens ............................ 117 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 120 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................................ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 122 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 128 DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton BMDC Bone marrow-derived dendritic cells Tế bào đuôi gai từ tủy xương CC Column chromatography Sắc kí cột COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H CTPT Công thức phân tử DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide ESI-MS Electron spray ionization mass spectra Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử Fl Fibril sarcoma of Uteus Ung thư màng tử cung Glc Glucopyranoside HeLa Henrietta lacks Ung thư cổ tử cung Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan người HL-60 Human leukemia 60 Ung thư bạch cầu HMBC Heteronuclear mutiple bond connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High resolution electronspray ionization mass spectrum Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử HSQC Heteronuclear single-quantum coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại KB Human epidemoid carcinoma Ung thư biểu mô người LNCaP Human prostatic carcinoma Ung thư tiền liệt tuyến người LU Human lung carcinoma Ung thư phổi người MCF7 Michigan cancer foundation-7 Ung thư vú người NF-B Nuclear factor kappa-light- chain-enhancer of activated B cells Yếu tố nhân kappa B NOESY Nuclear overhauser effect Spectroscopy Phổ NOESY OD Optical density Mật độ quang học Rha Rhamnopyranoside RD Rhabdo sarcoma Ung thư màng tim ROESY Rotating frame nuclear overhauser effect spectroscopy Phổ ROESY RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18 SRB Sulphorhodamine B TCA Trichloracetic acid Trichloracetic acid TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethyl silan TNF-α Tumor necrosis factor α Yếu tố hoại tử khối u α Xyl Xylopyranoside DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) của hợp chất 1-3 ............. 25 Bảng 1.2. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 4-6 ............................................. 26 Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên cao toàn phần của cây Xáo leo ... 37 Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 01 .............................................. 58 Bảng 4.2. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 02 .............................................. 62 Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 03 .............................................. 67 Bảng 4.4. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PS32 ......................................... 71 Bảng 4.5. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 05 .............................................. 74 Bảng 4.6. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PS30 ......................................... 77 Bảng 4.7. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 07 .............................................. 81 Bảng 4.8. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 08 .............................................. 85 Bảng 4.9. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 09 .............................................. 88 Bảng 4.10. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 10 ............................................ 90 Bảng 4.11. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 11 ............................................ 93 Bảng 4.12. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 12 ............................................ 95 Bảng 4.13. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 13 ............................................ 97 Bảng 4.14. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 14 ............................................ 99 Bảng 4.15. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 15 .......................................... 102 Bảng 4.16. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 16 .......................................... 105 Bảng 4.17. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 17 .......................................... 108 Bảng 4.18. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 18 .......................................... 111 Bảng 4.19. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 19 .......................................... 114 Bảng 4.20. Kết quả hoạt tính diệt tế bào ung thư in vitro của Paramignyol A và Paramignyol B ............................................................................................................. 115 Bảng 4.21. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất Paramignyoside A-E .................. 117 Bảng 4.22. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens ................. 117 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 2.1. Cây xáo leo - Paramignya scandens (Griff.) Craib....................................... 28 Hình 3.1. Sơ đồ tạo các dịch chiết từ cây P. scandens .................................................. 36 Hình 4.1. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết CHCl3 của cây P. scandens ............... 52 Hình 4.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W1 của cây P. scandens .......... 53 Hình 4.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W2 của cây P. scandens .......... 53 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 01 ..................................... 54 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 01 .................................... 55 Hình 4.6. Phổ NOESY của hợp chất 01 ........................................................................ 57 Hình 4.7. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 01 ............................... 57 Hình 4.8. Tương tác NOESY chính của hợp chất 01 .................................................... 57 Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất 01 ................................................................. 59 Hình 4.10. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 02 ................................... 59 Hình 4.11. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 02 .................................. 60 Hình 4.12. Phổ NOESY của hợp chất 02 ...................................................................... 61 Hình 4.13. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 02 ............................. 61 Hình 4.14. Tương tác NOESY chính của hợp chất 02 .................................................. 61 Hình 4.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất PS15 ........................................................... 63 Hình 4.16. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 03 ................................... 63 Hình 4.17. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 03 .................................. 64 Hình 4.18. Phổ COSY của hợp chất 03 ......................................................................... 65 Hình 4.19. Phổ ROESY của hợp chất 03 ...................................................................... 66 Hình 4.20. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY, HMBC và ROESY chính của hợp chất 03 .............................................................................................................. 67 Hình 4.21. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 04 ................................... 69 Hình 4.22. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 04 .................................. 70 Hình 4.23. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY ( ) và HMBC () chính của hợp chất 04 .............................................................................................................. 70 Hình 4.24. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 05 ................................... 72 Hìn