Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài belamcanda chinensis (l.) dc. thu hái tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU BÙI THỊ BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI BELAMCANDA CHINENSIS (L.) DC. THU HÁI TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU BÙI THỊ BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI BELAMCANDA CHINENSIS (L.) DC. THU HÁI TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: Dƣợc học cổ truyền MÃ SỐ: 9720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu 2. PGS.TS. Đỗ Thị Hà HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu và PGS.TS. Đỗ Thị Hà. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả luận án NCS. Bùi Thị Bình LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận án này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học cùng bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Bích Thu và PGS.TS. Đỗ Thị Hà, những ngƣời thầy đã tận tình hỗ trợ, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cám ơn Ban lãnh đạo, các Khoa, Phòng và các đồng nghiệp tại Viện Dƣợc liệu, Đại học Quốc gia Chung Nam (Hàn Quốc), Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thái Bình, Viện Hóa học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và cộng tác giúp tôi hoàn thành công trình này. Tôi xin chân thành cảm ơn NGND.TTƢT.GS.TS. Lƣơng Xuân Hiến - nguyên Hiệu trƣởng Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thái Bình, TTƢT.PGS.TS. Hoàng Năng Trọng - Hiệu trƣởng Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thái Bình đã động viên tinh thần và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và kinh phí để tôi hoàn thành luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn! NCS. Bùi Thị Bình MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 3 1.1. THỰC VẬT HỌC ......................................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại của Xạ can ................................................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật .............................................................................................. 3 1.1.3. Phân bố ............................................................................................................... 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC .......................................................................................... 4 1.2.1. Các hợp chất nhóm flavonoid ............................................................................ 4 1.2.2. Các hợp chất nhóm phenolic ............................................................................ 15 1.2.3. Các hợp chất nhóm iridal ................................................................................. 17 1.2.4. Các hợp chất nhóm xanthon ............................................................................ 21 1.2.5. Các hợp chất nhóm sterol ................................................................................ 21 1.2.6. Các hợp chất nhóm triterpen ............................................................................ 23 1.2.7. Các hợp chất nucleotid ..................................................................................... 23 1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC ............................................................................................. 24 1.3.1. Tác dụng chống viêm ....................................................................................... 24 1.3.2. Tác dụng chống ung thƣ .................................................................................. 25 1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ................................................................. 27 1.3.4. Tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa ........................................................... 27 1.3.5. Tác dụng trên bệnh tiểu đƣờng ........................................................................ 28 1.3.6. Tác dụng kiểu estrogen .................................................................................... 29 1.4. CÔNG DỤNG ............................................................................................................. 33 1.4.1. Tính vị và công năng ....................................................................................... 33 1.4.2. Công dụng ........................................................................................................ 33 1.4.3. Một số bài thuốc có Xạ can ............................................................................. 33 1.5. TỔNG QUAN VỀ VIÊM ............................................................................................ 34 1.5.1. Định nghĩa viêm ............................................................................................... 34 1.5.2. Nguyên nhân gây viêm .................................................................................... 34 1.5.3. Phân loại viêm.................................................................................................. 35 1.5.4. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm ........................................... 36 1.6. TỔNG QUAN VỀ TĂNG SINH TẾ BÀO ................................................................. 37 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 40 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 40 2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 40 2.1.2. Động vật thí nghiệm......................................................................................... 42 2.1.3. Thuốc thử, hóa chất, dung môi ........................................................................ 42 2.1.4. Máy móc, thiết bị ............................................................................................. 45 2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 47 2.2.1. Giám định tên khoa học .................................................................................... 47 2.2.2. Nghiên cứu hóa học .......................................................................................... 47 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học .......................................................................... 47 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................... 48 2.3.1. Giám định tên khoa học ................................................................................... 48 2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học....................................................................... 48 2.3.3. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học .............................................................. 54 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 64 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................................................................ 64 3.1.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ ...................................................................... 64 3.1.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất ................................................................ 65 3.1.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất ................................................................. 70 3.1.4. Định lƣợng các hợp chất chính trong thân rễ Xạ can .................................... 126 3.2. TÁC DỤNG SINH HỌC ........................................................................................... 133 3.2.1. Tác dụng chống viêm in vitro của thân rễ Xạ can ......................................... 133 3.2.2. Tác dụng chống viêm in vivo của thân rễ Xạ can .......................................... 147 3.2.3. Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn thành mạch máu của phần trên mặt đất Xạ can ................................................................................................................ 149 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................................. 151 4.1. VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 151 4.2. VỀ HÓA HỌC ........................................................................................................... 152 4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC .................................................................................... 161 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 171 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên viết đầy đủ Ac Acetyl ADN Acid deoxyribonucleic AP-1 Protein hoạt hóa-1 (actived protein 1) 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) COSY Correlation Spectroscopy COX-2 Cyclooxygenase-2 CTCT Công thức cấu tạo CTHH Cấu trúc hóa học EtOAc Ethyl acetat DCM Dichloromethan DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dex Dexamethanson DMEM Môi trƣờng cơ bản dùng cho nhiều dòng tế bào khác nhau (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50 Nồng độ có hiệu quả 50% (Effective Concentration 50%) EGF Yếu tố tăng trƣởng biểu bì (Epidermal Growth Factor) EI-MS Phổ khối ion hóa điện tử (Electronic ionization-Mass Spectrometry) ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol Glc Glucopyranosyl Tên viết tắt Tên viết đầy đủ GSH-px Glutathion peroxidase HepG2 Dòng tế bào ung thƣ gan ngƣời (Human hepatocellular carcinoma cell line) HL-60 Dòng tế bào ung thƣ bạch cầu tiền tủy bào ngƣời (Human promyelocytic leukemia cell line) HMBC Phổ tƣơng quan dị nhân đa liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) 1 H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HSCCC Sắc ký phân bố ngƣợc dòng tốc độ cao (High-Speed Counter-Current Chromatography) HSQC Phổ tƣơng tác dị nhân lƣợng tử đơn (Heteronuclear Single Quantum Coherence) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HPLC-DAD- ESI-MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD ghép với phổ khối ion hóa phun mù điện tử (High Performance Liquid Chromatography-Detector Diode Array-Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry) HPLC-DAD- MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD ghép với khối phổ (High Performance Liquid Chromatography-Detector Diode Array-Mass Spectrometry) HR-ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử phân giải cao (High Resolution-Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry) IC50 IFN-γ Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) Interferon gamma IL Interleukin Tên viết tắt Tên viết đầy đủ iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase IR Hồng ngoại (Infrared) KLPT Khối lƣợng phân tử LC-MS Sắc ký lỏng kết nối phổ khối (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry) LC-NMR Sắc ký lỏng kết hợp với cộng hƣởng từ hạt nhân (Liquid Chromatography–Nuclear Magnetic Resonance) LNCaP Ung thƣ biểu mô hạch bạch huyết của tuyến tiền liệt (Lymph Node Carcinoma of the Prostate) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) LPS Lipopolysaccharid m Khối lƣợng chất thu đƣợc MCF-7 Dòng tế bào ung thƣ vú (Human breast adenocarcinoma cell line) Melox Meloxicam MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide m/z Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lƣợng/điện tích) n-BuOH n-Butanol NF-κB Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor-kappa B) NMR Cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NO Nitric oxid NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy NOS Nitric Oxid Synthase NXB Nhà xuất bản PC-3 Dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt Tên viết tắt Tên viết đầy đủ PGE2 Prostaglandin E2 PMA Phorbol myristat acetat ppm P/ƣ Phần triệu (part per million) Phản ứng Rha Rhamnopyranosyl RIE Estrogenic relative inductive efficiency RP Hiệu lực tƣơng đối (Relative Potency) ROS Các gốc tự do có oxy (Reactive Oxygen Species) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) RWPE-1 Tế bào biểu mô gây ung thƣ tuyến tiền liệt SMMC-7721 Tế bào ung thƣ gan ngƣời SNUC-5 Tế bào ung thƣ ruột kết SOD Superoxid Dismutase STT Số thứ tự STZ Streptozotocin T-47D Dòng tế bào ung thƣ vú (Human breast cancer) PTMĐ Phần trên mặt đất TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TLTK Tài liệu tham khảo TNF-α Yếu tố hoại tử khối u alpha (Tumor Necrosis Factor -alpha) TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetat TT Thuốc thử TR Thân rễ U-937 Dòng tế bào ung thƣ máu UV Tử ngoại (Ultra violet) VSMC Tế bào cơ trơn mạch máu (Vascular Smooth Muscle Cell) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây Xạ can (Belamcanda chinensis) .................................... 4 Hình 1.2. Cấu trúc của hợp chất 2,3-dihydroirigenin phân lập từ Xạ can ........................... 7 Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất triterpen phân lập từ Xạ can .................................... 23 Hình 1.4. Cấu trúc của hợp chất uracil và uridin phân lập từ thân rễ Xạ can .................... 23 Hình 1.5. Các nhân tố ảnh hƣởng đến xơ vữa động mạch ................................................. 38 Hình 1.6. Sự biệt hóa VSMC trong mạch máu .................................................................. 39 Hình 2.1. Xạ can (Belamcanda chinnensis (L.) DC.) ........................................................ 41 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC1 .................................................................. 71 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC2 .................................................................. 72 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC3 .................................................................. 74 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC4 .................................................................. 76 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC5 .................................................................. 77 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học, các tƣơng tác HMBC (→) chính (A) và cấu trúc không gian (B) của hợp chất BC6 ......................................................................................................... 80 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC7 .................................................................. 82 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→) chính của hợp chất BC8 ......... 85 Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất BC9 .................................................................. 87 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→) chính của hợp chất BC10 ..... 90 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→) chính của hợp chất BC11 ..... 92 Hình 3.12. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất BC12 .............................. 94 Hình 3.13. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất BC12 ............................. 95 Hình 3.14. Phổ DEPT của hợp chất BC12 ........................................................................ 95 Hình 3.15. Tƣơng tác HMBC giữa proton H-2′ và carbon carbonyl ................................. 96 Hình 3.16. Tƣơng tác 1H-1H COSY giữa H-2′ và H-1′, H-3′ ............................................ 96 Hình 3.17. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BC12 .............................................................. 97 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→), COSY (▬) chính của hợp chất BC12 ........................................................................................................................... 97 Hình 3.19. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất BC13 .............................. 99 Hình 3.20. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất BC13 ........................... 100 Hình 3.21. Phổ DEPT của hợp chất BC13 ...................................................................... 100 Hình 3.22. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất BC13 .......................................... 102 Hình 3.23. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BC13 ............................................................ 103 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→) chính của hợp chất BC13 ... 103 Hình 3.25. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→) chính của hợp chất BC14 ... 105 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→), COSY (▬) chính của hợp chất BC15 ......................................................................................................................... 107 Hình 3.27. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→), COSY (▬) chính của hợp chất BC16 ......................................................................................................................... 109 Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→), COSY (▬) chính của hợp chất BC17 ................................................................................................................................. 111 Hình 3.29. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất BC18 ............................ 113 Hình 3.30. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất BC18 ........................... 114 Hình 3.31. Phổ DEPT của hợp chất BC18 ...................................................................... 114 Hình 3.32. Tƣơng tác HMBC của H-6ʺ và carbon carbonyl của nhóm acetyl ................ 115 Hình 3.33. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BC18 ............................................................ 115 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→), COSY (▬) chính của hợp chất BC18 ......................................................................................................................... 116 Hình 3.35. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất BC18 ............................ 118 Hình 3.36. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 225 MHz) của hợp chất BC18 ........................... 119 Hình 3.37. Phổ DEPT của hợp chất BC18 ...................................................................... 119 Hình 3.38. Tƣơng tác HMBC giữa H-3ʺ và carbon carbonyl của nhóm acetyl .............. 120 Hình 3.39. Tƣơng tác 1H-1H COSY giữa H-3ʺ và H-2ʺ, H-4ʺ ......................................... 120 Hình 3.40. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BC18 ............................................................ 121 Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (→), COSY (▬) chính của hợp chất BC19 ......................................................................................................................... 121 Hình 3.42. Sắc ký đồ dịch chiết phần thân rễ của các mẫu Xạ can ................................. 126 Hình 3.43. So sánh phổ hấp thụ UV của các pic trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn tƣơng ứng ........................