Luận án Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT KHÁNH HÒA - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG NGÀNH ĐÀO TẠO : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN MÃ SỐ : 62540105 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN KHÁNH HÒA - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình. Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Hoàng Ngọc Cương ii LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành là nhờ có nhà trường, các tổ chức có liên quan tạo điều kiện; thầy cô, bạn bè, gia đình giúp đỡ và hỗ trợ. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS. Trang Sĩ Trung và PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn đã định hướng, chỉ dẫn và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận án này. Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, các Phòng, Ban, Khoa, Viện liên quan đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án. Ban giám hiệu Trường Đại học Bình Dương, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án. TS. Nguyễn Văn Hòa, Ths. Nguyễn Công Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi trong quá trình thực hiện luận án. TS. Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa, TS. Khổng Trung Thắng đã giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu. Các cán bộ kỹ thuật của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trọng quá trình tiến hành nghiên cứu. Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, những người thân yêu luôn là nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hoàn thành. Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Hoàng Ngọc Cương iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................................... vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... viii ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................................................... xii PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 6 1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU NHẬN -CHITIN........................................................................................................... 6 1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến .. 6 1.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ..... 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN ................................................... 16 1.2.1. Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin ........ 16 1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan .................................................... 20 1.2.3. Phương pháp thu nhận chitin và chitosan ...................................................... 23 1.2.4. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan ............................. 36 1.3. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH ...... 39 1.3.1. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch ..................... 39 1.3.2. Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch ......... 41 1.3.3. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn .................... 42 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 45 2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................................. 45 2.1.1. Mai mực ống Loligo sp. ................................................................................. 45 2.1.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum ............................................................ 45 2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu .................................................................... 46 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 46 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ............................................................................ 46 2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin ................................. 49 iv 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan ..... 55 2.2.4. Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ........... 62 2.2.5. Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo ................................................................................................. 64 2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU ............................ 71 2.3.1. Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản ................................. 71 2.3.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng ............ 71 2.3.3. Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan ............................. 71 2.3.4. Phương pháp cắt mạch chitosan ..................................................................... 72 2.3.5. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ............. 73 2.3.6. Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora ..................... 74 2.3.7. Phương pháp gây bệnh nhân tạo .................................................................... 75 2.3.8. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro75 2.3.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 75 2.3.10. Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua ......... 76 2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 76 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 77 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP ...................................... 77 3.1.1. Thành phần hóa học cơ bản............................................................................ 77 3.1.2. Thành phần khoáng ........................................................................................ 79 3.1.3. Thành phần acid amin .................................................................................... 80 3.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP. ........................................................................................ 82 3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp. .................................................... 82 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin .................... 84 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin ...................................................................................... 85 3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin ...................................................................................... 88 v 3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin ......................................................................... 90 3.2.3. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống .......................................... 92 3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP. ..................................................................................................... 101 3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl -chitin ....................................................................... 101 3.3.2. Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan .................................................... 104 3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan ....................................................................................................................... 104 3.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl β-chitin và sự cắt mạch chitosan ................................................................................................ 107 3.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 108 3.3.3. Điều kiện deacetyl lần 2 ............................................................................... 110 3.3.4. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan ............................... 111 3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp. ...... 119 3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN .......................................... 120 3.4.1. Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch .............................................................................. 120 3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro ......................... 127 3.4.3. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo ............................... 131 3.4.4. Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp. ................................................................................................ 139 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 141 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ....................................... 143 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 144 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 158 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAS Atomic absorption spectrophotometric Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai -chitosan Chitosan from β-chitin Chitosan từ β-chitin χcr Degree of crystallinity Độ kết tinh C95 Tomato C95 Giống cà chua C95 CrI Crystalline Index Chỉ số kết tinh DA Degree of acetyl Độ acetyl DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DD Degree of deacetyl Độ deacetyl DP Deproteinization Quá trình khử protein DM Demineralization Quá trình khử khoáng DC Decolorization Quá trình khử màu Ecc Erwinia carotovora subsp. carotovora Erwinia carotovora subsp. carotovora Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica Erwinia carotovora subsp. atroseptica Echr Erwinia chrysanthemi Erwinia chrysanthemi EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic axit FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại GlcN D-glucosamine D-glucosamine GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MHS Mark-Houwink-Sakurada equation Phương trình Mark-Houwink- Sakurada Mw The average molecular weight Khối lượng phân tử trung bình NL/DM Material / solvent Nguyên liệu / dung môi vii Nd Not detected Không phát hiện NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD Optical density Độ hấp phụ quang học Pl Pectate lyases Enzyme phân giải pectin Pnl Pectin lyases Enzyme phân giải pectin Pme Pectin methylesterases Enzyme phân giải pectin PA Polyamide Bao nylon PG Potato glucose Môi trường potato glucose PCR Polymerase chain reaction Phương pháp khuếch đại gen PDA Potato dextrose agar Môi trường thạch khoai tây rARN Ribosomal ribonucleic ARN riboxom SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét SEC-MALLS Size-exclusion chromatography- Multi-angle static light scattering Phương pháp sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh đa góc sp. Species Loài spp. Species pluriel Nhiều loài subsp. Subspecies Phân loài SPSS Statistical Package for the Social Sciences Phần mềm thống kê SS Sum of Squares Tổng bình phương độ lệch TEM Transmission Electron Microscope Kính hiển vi điện tử truyền qua TpHCM Ho Chi Minh City Thành phố Hồ Chí Minh TLTK References Tài liệu tham khảo VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers Hiệp hội chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam VNF Viet Nam Food Công ty Cp Việt Nam Food XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X wt.% Weight percent Phần trăm theo khối lượng viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin ................................................................................. 8 Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong một số mai mực .................................................... 9 Bảng 1.3. Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực ............................................... 9 Bảng 1.4. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan ...................................... 21 Bảng 1.5. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl ....................................... 22 Bảng 1.6. Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại ..................... 22 Bảng 1.7. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên liệu khác nhau .............................................................................................................. 30 Bảng 1.8. Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin............................ 32 Bảng 1.9. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau .......... 34 Bảng 1.10. Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện deacetyl khác nhau .............................................................................................................. 36 Bảng 1.11. Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) .............. 43 Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp .............................. 77 Bảng 3.2. Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm ..... 79 Bảng 3.3. So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp. và kết quả tham khảo ....................................................................................................................... 80 Bảng 3.4. Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin ........................................ 94 Bảng 3.5. Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin ............................ 95 Bảng 3.6. Hàm lượng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin ......................... 95 Bảng 3.7. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin .. 100 Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan ............................................................ 112 Bảng 3.9. So sánh chất lượng của thương mại chitosan và β-chitosan ....................... 113 Bảng 3.10. Hàm lượng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan ...................... 114 Bảng 3.11. Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan .. 115 Bảng 3.12. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan .. 118 Bảng 3.13. Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản .............................................. 121 Bảng 3.14. Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn .......... 123 Bảng 3.15. Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối lượng phân tử khác nhau và chitosan thương mại (C-120) ........................................... 128 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b) Mai mực. ........................................................................................................................ 6 Hình 1.2. Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu . ................................... 10 Hình 1.3. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu. ............................................. 11 Hình 1.4. Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm. ........................................................................ 11 Hình 1.5. Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống. ................................. 12 Hình 1.6. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. .... 13 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học phân tử chitin. .................................................................... 17 Hình 1.8. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin. .............. 17 Hình 1.9. Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin. ..................................................... 18 Hình 1.10. Cấu trúc α-chitin và -chitin. ..................................................................... 19 Hình 1.11. Phổ XRD của α-chitin và β-chitin. .............................................................. 19 Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của chitosan. .................................................................... 20 Hình 1.13. Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản. .................... 24 Hình 1.14. Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan. ........................................................ 33 Hình 1.15. Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot). ........................................................... 41 Hình 2.1. Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ............................................................ 45 Hình 2.2. Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum. ............................................ 46 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. ................................................................. 47 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu. .................. 49 Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử protein mai mực ống. ............................................................................................ 51 Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian ..................................... 53 Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình khử protein. ..............