Luận án Nghiên cứu vi nấm trong nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và cá lóc (channa striata) thâm canh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỤY MAI THY NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ LÓC (Channa striata) THÂM CANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 62620301 Cần Thơ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỤY MAI THY NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ LÓC (Channa striata) THÂM CANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 62620301 Cán bộ hƣớng dẫn: PGS. TS. PHẠM MINH ĐỨC PGS. TS. TRẦN THỊ TUYẾT HOA Cần Thơ, 2017 LỜI CẢM TẠ Kính gởi lời chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, Ban lãnh đạo Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ. Hơn nữa, xin cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo đã hỗ trợ nguồn kinh phí giúp tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu. Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Minh Đức đã dành thời gian quý báu, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án tốt nghiệp. Đặc biệt, xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Trần Thị Tuyết Hoa đã luôn sẵn sàng hướng dẫn, hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Xin chân thành cảm ơn tập thể Quý Thầy Cô và các em thuộc Bộ môn Bệnh học Thủy sản đã giúp đỡ, chia sẽ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi. Và xin cảm ơn tất cả các bạn nghiên cứu sinh và các em sinh viên đại học đã luôn hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc gia đình và người thân đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành được luận án nghiên cứu này. Xin trân trọng cảm ơn tất cả. NCS ĐẶNG THỤY MAI THY ii TÓM TẮT Vi nấm là một trong những tác nhân gây bệnh ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá lóc (Channa striata) nuôi ao thâm canh trong những năm gần đây. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định đặc điểm bệnh học, sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc, hóa chất và thảo dược sử dụng phòng trị bệnh vi nấm làm cơ sở đề xuất biện pháp phòng và trị bệnh do vi nấm. Tổng số 60 mẫu nước, 153 mẫu cá tra và 197 mẫu cá lóc được thu định kỳ tại ao cá tra và cá lóc ở An Giang và Cần Thơ trong 5 tháng của chu kỳ nuôi. Cá tra giống (116 mẫu) và cá tra giai đoạn nuôi thương phẩm (207 mẫu) bệnh trương bóng hơi được thu ở 4 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Cá lóc bệnh (242 mẫu) được thu tại 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Vĩnh Long và Trà Vinh. Kết quả nghiên cứu đã xác định được: (i) chín (09) giống vi nấm gồm Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Aspergillus, Fusarium và Tricoderma xuất hiện trong môi trường nước ao nuôi cá tra và cá lóc; (ii) Năm (05) giống vi nấm gồm Achlya, Saprolegnia, Mucor, Aspergillus và Fusarium được phân lập từ cá tra bệnh. Cá tra bị trương bóng hơi có tỉ lệ nhiễm Fusarium đến 94,8%; (iii) Năm (05) giống vi nấm gồm Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Aspergillus và Fusarium phân lập được từ cá lóc bệnh. Nghiên cứu xác định đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra cho thấy Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) là tác nhân gây bệnh trương bóng hơi trên cá tra và chủng F1509 có khả năng gây bệnh cao nhất. Mô bóng hơi cá tra bệnh bị biến đổi và cấu trúc của tế bào biểu mô, mô sợi và mô liên kết bị thoái hóa và hoại tử. Đặc biệt, bên trong các xoang bóng hơi có sự hiện diện dày đặc các sợi nấm. Đặc điểm hình thái của các chủng vi nấm gây bệnh giống nhau. Kết quả nghiên cứu cũng xác định 5 chủng Achlya bisexualis có khả năng gây bệnh trên cá lóc trong đó chủng ĐT0232 có độc lực cao nhất. Cá lóc mẫn cảm với vi nấm A. bisexualis hơn cá tra. Nghiên cứu mô bệnh học ghi nhận nhiều sợi nấm xuất hiện trên vết thương ở da, tế bào biểu mô bị hoại tử. Hiện tượng thoái hóa được ghi nhận ở lớp biểu bì, lớp bì và dưới cơ. Sợi nấm nhiễm vào lớp biểu bì đến cơ với sự xuất hiện của một vài u hạt xung quanh sợi nấm. Đặc điểm sinh học của FIESC và A. bisexualis giống nhau. Nhiệt độ thích hợp cho hai loài này phát triển từ 28-33C, pH 6-8, độ mặn 0-0,5%. Vi nấm sử dụng carbohydrate chủ yếu là glucose và sucrose. Trong môi trường có NO2 nồng độ 5mM thì FIESC và A. bisexualis có thể tồn tại và phát triển. Bronopol và iodne ức iii chế FIESC ở nồng độ ≥400 mg/L và CuSO4 ≥200 mg/L. A. bisexualis bị ức chế ở nồng độ bronopol và CuSO4 ≥100 mg/L, iodine ≥200 mg/L. Cỏ mực ức chế sự phát triển của A. bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex tốt hơn diệp hạ châu. Sử dụng thức ăn bổ sung 10 g cỏ mực/kg thức ăn có hiệu quả hạn chế nhiễm vi nấm trên cá lóc và cá tra. Từ khóa: Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata), Achlya bisexualis, Fusarium incarnatum-equiseti complex, bệnh nấm. iv ABSTRACT Fungi have been one of the pathogen causing diseases on striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) and snakehead fish (Channa striata) cultured in intensive ponds in recent years. The aim of present study is to investigate pathogenic and biological characteristics of some disease-causing fungi on striped catfish and snakehead and to evaluate effects of chemicals and herbal extracts on the prevention and treatment of fungal diseases as the basis for the management of these diseases. A total of 60 water samples, 153 striped catfish samples and 197 snakehead fish samples were collected in ponds in An Giang and Can Tho over a period of 5-month production cycle. Catfish fingerlings (116 samples) and swollen swim bladder fish aldults (207 samples) were collected in 4 provinces (An Giang, Can Tho, Vinh Long and Dong Thap). Snakehead fish diseases (242 samples) were also collected from 6 provinces (An Giang, Can Tho, Dong Thap, Hau Giang, Vinh Long and Tra Vinh). Results showed that (i) nine fungal genera Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Aspergillus, Fusarium and Tricoderma were identified from the water samples; (ii) five fungal genera Fusarium, Aspergillus, Achlya, Saprolegnia and Mucor were identified from striped catfish. Fusarium was detected as the causative agent of swollen swim bladder in striped catfish with a high infection rate of 94.8% (iii) five fungal genera Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Aspergillus và Fusarium were identified from snakehead. This study showed that Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) caused swollen swim bladder in striped catfish and the F1509 strain had the highest virulence. Histopathology of swim bladder was changed and the epithelial cell, fibrio and connective tissue showed degeneration and necrosis. A dense presence of fungal hyphae was found in the sinus of the swim bladder. Morphological characteristics of the strains were similar. Another result was that the five strains of Achlya bisexualis were the causative agents in snakehead, of which the ĐT0232 strain had the highest virulence. Snakehead was sensitive to fungal diseases more than striped catfish. A histopathological examination of the snakehead skin showed degeneration in the epidermis, dermis and underlying muscle. The hyphae were observed to penetrate into the epidermis to the musculature with some granulomatous response surrounding the hyphae. v Biological characteristics of Achlya bisexualis and Fusarium incarnatum- equiseti complex were the same. The optimal temperature of FIESC ranged from 28 o C to 33 o C, pH level was 6-8 and salinity was 0-0,5%. The strains could use glucose and sucrose. FIESC and A. bisexualis could survive and grow in the media supplied with nitrite (5mM). Bronopol and iodne inhibited FIESC, which were at the concentration of ≥400 ppm and CuSO4 at ≥200 ppm. Similarly, Achlya bisexualis was inhibited with concentrations of bronopol and CuSO4 at ≥100 ppm, and iodine at ≥200 ppm. False daisy (Eclipta prostrata) showed better inhibition than chamber bitter (Phyllanthus niruri) extracts in the hyphal growth of A. bisexualis and Fusarium incarnatum-equiseti complex. Using false daisy with the concentration of 10g/kg was effective with fungal diseases on both P. hypophthalmus and C. striata. Keyword: Striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus), snakehead fish (Channa striata), Achlya bisexualis, Fusarium incarnatum-equiseti species complex, fungal diseases. vi Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh ĐẶNG THỤY MAI THY vii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................... i TÓM TẮT ............................................................................................................................. ii ABSTRACT .......................................................................................................................... iv LỜI CAM KẾT ..................................................................................................................... vi MỤC LỤC ............................................................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... xi DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................. xv Chƣơng 1: GIỚI THIỆU .................................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu .................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.3 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................. 3 1.4 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 3 1.5 Ý nghĩa của luận án .................................................................................................. 3 1.6 Điểm mới của luận án ............................................................................................... 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 5 2.1 Đặc điểm của vi nấm ................................................................................................ 5 2.1.1 Cấu tạo vi nấm ................................................................................................ 5 2.1.2 Phân loại ......................................................................................................... 6 2.1.3 Đặc điểm sinh sản của vi nấm ......................................................................... 8 2.2 Một số nghiên cứu vi nấm trong môi trường nước ................................................... 10 2.3 Nghiên cứu vi nấm gây bệnh trên động vật thủy sản ............................................... 12 2.3.1 Bệnh do vi nấm Saprolegniasis ...................................................................... 12 2.3.2 Bệnh do vi nấm Fusarium............................................................................... 17 2.3.3 Bệnh do vi nấm khác....................................................................................... 20 2.3.4 Bệnh do vi nấm trên cá ở Việt Nam ................................................................ 21 2.4 Nghiên cứu hóa chất phòng trị bệnh do vi nấm ở động vật thủy sản ....................... 22 2.4.1 Bronopol ......................................................................................................... 22 2.4.2 Iodine .............................................................................................................. 23 2.4.3 Đồng sunfat ..................................................................................................... 24 2.5 Một số nghiên cứu thảo dược phòng trị bệnh ở động vật thủy sản .......................... 25 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 28 3.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................... 28 3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 28 viii 3.3 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 28 3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi nấm, thuốc kháng sinh, ............................................. 28 3.3.2 Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 29 3.4.1 Xác định thành phần giống loài vi nấm trong môi trường ao nuôi ................. 30 3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu ............................................................................ 30 3.4.1.2 Phương pháp phân tích mẫu nước ......................................................... 30 3.4.1.3 Phương pháp định danh vi nấm ............................................................. 30 3.4.2 Xác định thành phần giống loài vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc ............... 31 3.4.2.1 Phương pháp thu mẫu ............................................................................ 31 3.4.2.2 Phương pháp phân lập vi nấm ............................................................... 33 3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học vi nấm gây bệnh ở cá tra và cá lóc ............... 33 3.4.3.1 Nguồn cá tra và cá lóc khỏe sử dụng ở thí nghiệm cảm nhiễm ............. 33 3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy sinh bào tử vi nấm ............................................ 34 3.4.3.3 Thí nghiệm cảm nhiễm 1 trên cá tra: ..................................................... 34 3.4.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm 2 trên cá tra: ..................................................... 35 3.4.3.5 Thí nghiệm cảm nhiễm 3 trên cá tra: ..................................................... 36 3.4.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm 4 trên cá lóc: .................................................... 37 3.4.3.7 Thí nghiệm cảm nhiễm 5 trên cá lóc: .................................................... 38 3.4.3.8 Thí nghiệm cảm nhiễm 6 trên cá tra và cá lóc: ...................................... 39 3.4.4 Phương pháp định danh vi nấm ...................................................................... 40 3.4.4.1 Phương pháp định danh truyền thống .................................................... 40 3.4.4.2 Phương pháp sinh học phân tử định danh vi nấm .................................. 40 3.4.5 Phương pháp mô học ...................................................................................... 42 3.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc ........................................................................................................................ 42 3.4.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của vi nấm ............... 42 3.4.6.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của vi nấm ....................... 43 3.4.6.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng phát triển của vi nấm................. 43 3.4.6.4 Khả năng sử dụng carbohydrat của vi nấm ........................................... 43 3.4.6.5 Khả năng sử dụng nitrite của vi nấm ..................................................... 44 3.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm ..................................................................................................... 44 3.4.8 Thí nghiệm sử dụng cỏ mực phòng bệnh do vi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm ..................................................................................................................... 46 3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 47 ix CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 48 4.1 Vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc .................................................... 48 4.1.1 Thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc ....................... 48 4.1.2 Đặc điểm hình thái vi nấm trong môi trường ao nuôi .......................... 51 4.2 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc theo chu kỳ nuôi .................... 57 4.3 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra ở thời điểm cá bệnh ...................................... 59 4.3.1 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra giống .................................................... 59 4.3.2 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra bệnh giai đoạn nuôi thương phẩm ....... 62 4.4 Đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá tra .................................................... 63 4.4.1 Khả năng gây bệnh của 5 giống vi nấm ở cá tra ............................................. 63 4.4.2 Khả năng gây bệnh của các chủng Fusarium sp. ở cá tra ............................... 65 4.4.3 Khả năng gây bệnh của các chủng Fusarium sp. ở các mật độ khác nhau ..... 67 4.4.4 Biến đổi mô học ở cá tra bệnh do Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) ..................................................................................................... 69 4.4.5 Kết quả định danh vi nấm gây bệnh trên cá tra ............................................... 72 4.4.5.1 Đặc điểm hình thái Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) gây bệnh trên cá tra .................................................................................................... 72 4.4.5.2 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............. 73 4.5 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá lóc bệnh .............................................................. 76 4.5.1 Dấu hiệu bệnh lý ............................................................................................. 76 4.5.2 Thành phần và tỉ lệ vi nấm nhiễm trên cá lóc bệnh ........................................ 77 4.6 Đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá lóc.................................................... 79 4.6.1 Khả năng gây bệnh của 5 giống vi nấm phân lập ở cá lóc .............................. 79 4.6.2 Khả năng gây bệnh của Achlya bisexualis ở cá lóc ........................................ 81 4.6.3 Khả năng gây bệnh của Achlya bisexualis ở cá lóc và cá tra .......................... 84 4.6.4 Biến đổi mô học ở cá lóc bệnh do vi nấm ....................................................... 86 4.6.5 Kết quả định danh nấm gây bệnh trên cá lóc .................................................. 90 4.6.5.1 Đặc điểm hình thái của Achlya gây bệnh trên cá lóc .............................. 90 4.6.5.2 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............. 92 4.7 Đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc .................................. 94 4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi nấm .................................... 94 4.7.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi nấm ....................................