Luận án Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested - Pcr chẩn đoán nhiễm nấm

BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI, 2019 BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62 72 01 16 Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Cao Trường Sinh PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình HÀ NỘI, 2019 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Cao Trường Sinh, PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình, đã nhiệt tình chỉ dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! PGS.TS. Trần Thanh Dương Viện trưởng và Ban Giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; PGS. TS. Cao Bá Lợi cùng toàn bộ cán bộ Phòng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Ban chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người” Mã số CK.10.32/11-15. PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực, TS. Đỗ Ngọc Ánh cùng toàn thể cán bộ bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng Học viện Quân Y; Khoa Sinh học phân tử Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học Quân sự Học viện Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Viện Chợ Rẫy; Khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh; Bệnh viện Quân y 103; Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. GS.TS. Lê Bách Quang, PGS.TS. Nguyễn Mạnh Hùng, PGS. TS Nguyễn Ngọc San, đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, Chồng, Con, anh chị em trong gia đình và bạn bè đồng nghiệp đã động viên khích lệ tôi vượt qua mọi khó khăn hoàn thành luận án. Luận án chỉ là bước đầu trong sự nghiệp khoa học. Những lời cảm ơn là chưa đủ vì làm sao kể hết những tình cảm thật ii cao quý, những tình cảm đó sẽ theo tôi trong suốt cuộc đời không bao giờ thay đổi! Trần Thị Quỳnh Liên iii LỜI CAM ĐOAN Đây là một nhánh của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người” Mã số CK.10.32/11-15 mà tôi đã trực tiếp tham gia. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả, số liệu thu được trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ luận án nào khác. Các bước tiến hành thực hiện đề tài đúng như đề cương nghiên cứu, chấp hành đầy đủ các quy định khi tiến hành nghiên cứu. Nếu có sai sót gì tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Trần Thị Quỳnh Liên iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) ADN ARV Acid Deoxyribonucleic Antiretroviral (Liệu pháp kháng retro vi rút) CFU Colony forming units (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CNS Central nervous system (Hệ Thần kinh Trung ương) CS Cộng sự CSF DNT Cerebrospinal fluid (Dịch não tủy) Dịch não tủy ELISA Enzyme-Linked immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết enzym) EIA Enzym immunoassay (thử nghiệm miễn dịch enzym) FP False positive (Dương tính giả) FN False negative (Âm tính giả) GACA Giuzotia abyssinica creatinin agra (Thạch nuôi cấy GACA) GRHP Ground red hot pepper agar (Thạch ớt đỏ) HE Hematoxylin eosin (Nhuộm HE) HIV Human immunodeficinecy Virus (vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người) K Kappa (Hệ số tương đồng) LAT Latex agglutination assay test (Thử nghiệm đông kết latex) LFA Lateral flow assay (Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy) MRI Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hưởng từ) NPV Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm) PCR Polymerase chairn reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PAS Periodic acid schiff (nhuộm PAS) v PPV Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn) Se Sensitivity (Độ nhạy) SOP Standard operating procedure (Quy trình các thao tác chuẩn) Sp Specificity (Độ đặc hiệu) TN True negative (dương tính giả) TP True positive (dương tính thật) vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. iv ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans .. 3 1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans. ........................................... 3 1.1.2. Vai trò y học ............................................................................................ 5 1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và Việt Nam ................................................................................................................... 9 1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans ...... 13 1.2.1. Chẩn đoán trực tiếp ............................................................................... 14 1.2.2. Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên .............................. 16 1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử ........................................... 17 1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh .................................................................................................. 23 1.3.1. Thiết kế và chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR ....................... 25 1.3.2. Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR ....................................... 27 1.3.3. Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật ...... 31 1.4. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh .................................................................. 32 1.4.1.Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán ........... 32 1.4.2. So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm .......................................... 35 1.4.3. Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm ............................................... 36 1.4.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm ...................................... 36 vii Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 37 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu .............................................. 37 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 37 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 38 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: ........................................................................... 39 2.2. Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................... 39 2.2.1. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc ............................................. 39 2.2.2. Sinh phẩm hóa chất ............................................................................... 39 2.2.3. Các hóa chất, sinh phẩm khác ............................................................... 40 2.2.4. Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao ........................................................ 40 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 40 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm ....... 40 2.3.2. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 42 2.3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 44 2.3.4. Các chỉ số nghiên cứu ........................................................................... 50 2.3.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 51 2.4. Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu ....................... 63 2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ................................................... 63 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ........................................................................ 66 2.7. Nhiễm sai số và cách hạn chế .................................................................. 66 2.8. Hạn chế của đề tài .................................................................................... 67 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 68 3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ............................................................. 68 3.1.1. Kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng cho nghiên cứu ................................................................................................................... 68 viii 3.1.2. Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans .............................................................................. 71 3.1.3. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans .............................................................................. 78 3.1.4. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ................................................................................................. 92 3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy .......................................... 97 3.2.1. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm ................................................................................... 97 3.2.2. Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu DNT lâm sàng .... 102 3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế tạo ra .............................................................................................................. 107 Chương 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 109 4.1. Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ........................................................... 109 4.1.1. Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C. neoformans để sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình ............................................................... 109 4.1.2. Về kết quả thiết kế/lựa chọn mồi và xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans ....................................... 112 4.1.3. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans ................................................................................................ 122 4.2. Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy. .................................... 124 4.2.1. Bàn luận về kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm ............................................................... 125 ix 4.2.2. Bàn luận về kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong đoán nhiễm C. neoformans ở các mẫu DNT lâm sàng .......................................................... 127 4.2.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu nhiễm C.neoformans phân lập ở Việt Nam. .................................................................................... 127 KẾT LUẬN ................................................................................................... 133 1. Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans ............................................................................. 133 2. Về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans dịch não tủy. .............................................. 134 KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 135 TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI ................................................. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI .............................................................. DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ ..................................................................... TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Nấm C. neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi .... 4 Hình 1.2. Khuẩn lạc C. neoformans trên môi trường thạch Sabouraud ............ 5 Hình 1.3.Tổn thương não do C. neoformans .................................................... 7 Hình 1.4. Hình ảnh tổn thương phổi do C. neoformans.................................... 8 Hình 1.5. Tổn thương da do nấm C. neoformans.............................................. 8 Hình 2.1. Chủng chuẩn nấm C. neoformans ATCC@ 90113 .......................... 37 Hình 2.2. Môi trường thạch Sabouraud trên đĩa thạch và ống thạch nghiêng 53 Hình 2.3. Phương pháp pha loãng dịch não tủy .............................................. 55 Hình 3.1. Mẫu nấm C. neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam ............... 69 Hình 3.2. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm C. neoformans ...................................................................................................... 69 Hình 3.3. Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme MspI của một số mẫu nấm C. neoformans...................................................... 70 Hình 3.4. Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn ...... 72 Hình 3.5. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần mềm Primer Blast ............................................................................................ 74 Hình 3.6. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần mềm Primer Blast ............................................................................................ 75 Hình 3.7. So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi ITS1, ITS4 và các trình tự C. neoformans trên ngân hàng gen ...................... 76 Hình 3.8. Kết quả PCR theo panel nồng độ .................................................... 79 Hình 3.9. Kết quả phản ứng PCR1 tiến hành theo quy trình tự xây dựng ...... 83 Hình 3.10. Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg2+ ............................................... 85 Hình 3.11. Phản ứng PCR theo gradien .......................................................... 86 Hình 3.12. Kết quả PCR theo thời gian kéo dài mồi ...................................... 86 xi Hình 3.13. Kết quả PCR theo số chu kỳ phản ứng ......................................... 87 Hình 3.14. Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn ....................................... 88 Hình 3.15. Kết quả PCR2 các mâũ N117 và N132 .......................................... 91 Hình 3.16. Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đoán C. neoformans ................ 96 Hình 3.17. Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C. neoformans bằng kỹ thuật nested-PCR .................................................................................................... 103 xii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý mẫu khác nhau ................................................................................................. 15 Bảng 1.2. Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C. neoformans của hãng Norgen Biotek .............................................................................................................. 23 Bảng 1.3. Thành phần phản ứng PCR thông thường với thể tích 50 µl ........ 29 Bảng 1.4. Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR thông thường ...................... 30 Bảng 2.1. Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm ................................... 40 Bảng 2.2. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR .................................... 61 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt PCR1 được thiết lập cho việc nhân bản đoạn gen kích thước khoảng 100bp - 600 bp.................................................................. 61 Bảng 2.4. Minh họa chạy gradient nhiệt độ và nồng độ Mg2+ ........................ 62 Bảng 3.1. Kết quả thu thập và phân lập nấm C. neoformans ........................... 68 Bảng 3.2. Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen ........................................................... 70 Bảng 3.3. Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để định loại nấm C. neoformans 1990 - 2014 ............................................................................. 71 Bảng 3.4. Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn ............................. 73 Bảng 3.5. Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau .. 77 Bảng 3.6. Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C. neoformans ............... 78 Bảng 3.7. Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C. neoformans ...................... 79 Bảng 3.8. Danh mục chứng chuẩn âm ............................................................ 80 Bảng 3.9. Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau ...... 81 Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1 ............ 82 Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 ................................ 82 Bảng 3.12. Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2 ....... 84 xiii Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2 ........... 84 Bảng 3.14. Điều kiện của phản ứng PCR2 với cặp mồi CN4 và CN5 ........... 87 Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR2 ............................................. 88 Bảng 3.16. Thử nghiệm đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR ...... 89 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm C. neoformans thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam .................................. 90 Bảng 3.18. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX1 ........................ 92 Bảng 3.19. Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX2 ........................ 92 Bảng 3.20. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR1 ...................... 93 Bảng 3.21. Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR2 ...................... 93 Bảng 3.22. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR1 .............................. 93 Bảng 3.23. Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR2 .............................. 94 Bảng 3.24. Kết quả đánh giá hoạt động 02 dạng đóng gói ............................. 95 Bảng 3.25.Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C.neoformans .................................................................................................. 96 Bảng 3.26. Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu C. neoformans chuẩn ....... 98 Bảng 3.27. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu chuẩn ....................................................................................................... 98 Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm ..........