Luận án Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (actinobacteria) từ hải miên vùng biển hà tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙNG BIỂN HÀ TIÊN VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT SINH HỌC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 62420201 NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙNG BIỂN HÀ TIÊN VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT SINH HỌC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN GS.TS. CAO NGỌC ĐIỆP PGS.TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NĂM 2022 iCHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” do nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương thực hiện theo sự hướng dẫn của GS.TS. Cao Ngọc Điệp và PGS.TS Ngô Thị Phương Dung. Luận án đã được báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: //2022. Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại . Thư ký Ủy viên Ủy viên Phản biện 1 Phản biện 2 Phản biện 3 Người hướng dẫn chính GS.TS. Cao Ngọc Điệp Người hướng dẫn phụ PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung Chủ tịch Hội đồng ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi nhận được rất nhiều sự hỗ trợ từ Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, nhiều Thầy, Cô, đồng nghiệp, các học viên và sinh viên. Tôi xin chân thành tri ân sâu sắc đến GS.TS. Cao Ngọc Điệp và PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung , đã tận tình hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành luận án. Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, quý đồng nghiệp đã tạo điều k iện tốt nhất cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu. Chân thành cảm ơn quý thầy cô tham gia đào tạo chương trình nghiên cứu sinh ngành công nghệ sinh học của Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu. Chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng thí nghiệm của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Phòng thí nghiệm hóa, Khoa Khoa học Tự nhi ên các học viên cao học và các em sinh viên đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ cho tôi hoàn thành luận án này. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân yêu trong gia đình luôn đồng hành, động viên, giúp tôi vượt qua khó kh ăn và hoàn thành quá trình học tập, nghiên cứu. Trân trọng cảm ơn. Nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương iii TÓM TẮT Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sợi (VKS) (Actinobacteria) từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi khuẩn gây bệnh ” được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn được những dòng VKS từ hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn tốt. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật (VSV) được thử nghiệm. Dựa vào kết quả khả năng kháng VSV gây bệnh của các dòng VKS, thứ tự số dòng có khả năng kháng năm loài VSV được thử nghiệm từ cao nhất đến thấp nhất được xác định như sau: Bacillus cereus (82 dòng, Salmonella typhimurium (73 dòng,), Candida albicans (42 dòng), Escherichia coli (39 dòng) và Staphylococcus aureus (22 dòng). Hai mươi ba dòng VKS có khả năng kháng ít nhất hai loại VSV thử nghiệm và mức độ kháng từ trung bình đến kháng mạnh, được tuyển chọn và định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen. Kết quả cho thấy có bốn họ gồm Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae và Gordoniaceae. Sự khác biệt về tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, bao gồm PKS-I, PKS-II và NRPS, được xác định tương ứng lần lượt như sau: 16/23 dòng, 14/23 dòng và 11/23 dòng. Hai dòng VKS có khả năng kháng khuẩn cao nhất, gồm Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c, được tuyển chọn để phân tích và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học. Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ S. tateyamensis ND1.7a gồm có: thymine, 2-pentanone-4-hydroxy-4- methyl, cyclohexasiloxane dodecamethyl, cycloheptasiloxane tetradecamethyl, oxime- methoxy-phenyl, hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate. Từ dòng M. tumbae ND2.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl- 3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5- tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4- dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12-dione, 2-propyl-1- pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10.10- nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester. Các hợp chất phát hiện từ hai dòng VKS này đã được nhiều nhà nghiên cứu công bố có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn. Các kết quả của đề tài là công trình nghiên cứu đầu tiên về VKS trong hải miên ở vùng biển Hà Tiê n, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. Từ khóa: Hải miên, Microbacterium, Streptomyces, vi khuẩn sợi, vùng biển Hà Tiên. iv ABSTRACT The study “Isolation and selection of actinobacteria from sponges at Ha Tien sea territory and identification of bioactive metabolites against pathogenic bacteria” was carried out with the aim to isolate and select actinobacterial strains from sponges, which have the ability to produce high antibacterial activity compounds. A total of 198 actinobacterial strains was isolated from sponges, of which 130/198 isolates were resistant to at least one of the five tested bacteria. Based on the results of antibacterial activity of the actinobacterial isolates, the strength of resistance to the five bacterial pathogens in a range from the strongest to the lowest were found as follows: Bacillus cereus (82 strains), Salmonella typhimurium (73 strains), Candida albicans (42 strains), Escherichia coli (39 strains), and Staphylococcus aureus (22 strains). The twenty-three actinobacterial isolates against at least two of the five tested bacteria with moderate to high resistance were selected and characterized by the genetic sequencing method. They were identified to be belonged to four genera: Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae, and Gordoniaceae. The difference of present rate of genes indicating the production of biologically active substances, including PKS-I, PKS-II, and NRPS, was found as follows: 16/23 strains, 14/23 strains, 11/23 strains; respectively. The two actinobacterial strains having the highest antibacterial ability, Streptomyces tateyamensis ND1.7a and Microbacterium tumbae ND2.7c, were selected for analysis and identification of biologically active compounds. Seven compounds produced from S. tateyamensis ND1.7a were found including thymine, 2- Pentanone-4-hydroxy-4-methyl, cyclohexasiloxane dodecamethyl, cycloheptasiloxane tetradecamethyl, oxime- methoxy-phenyl, hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester, and diisooctyl phthalate. For M. tumbae ND2.7c, 11 compounds were determined as follows: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1,1,1,7,7,7- hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7- hexamethyl -3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12-dione, 2- Propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)- 2,4,4,6,6,8,8,10,10-nonamethylcyclopentasiloxane, and phthalic acid monoethyl ester. The compounds produced by these two actinobacterial strains were reported by numbers of researchers in the context of their useful biological activities, especially antifungal and antibacterial activities. The result of this study is the first research on actinobacteria in sponges in Ha Tien Sea and it can be used as a basis for further studies, in which to explore the new kinds of medicine produced from symbiotic microorganisms with sponges contributing to protect human health. Keywords: Actinobacteria, Ha Tien Sea, Microbacterium, sponges, Streptomyces. vLỜI CAM ĐOAN Tôi tên Trần Vũ Phương, là nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học khóa 2016. Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân tôi được sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Cao Ngọc Điệp và PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung. Các thông tin sử dụng tham khảo trong đề tài luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng ở phần Danh mục Tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây . Tôi lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Người hướng dẫn GS.TS. Cao Ngọc Điệp Nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương vi MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT.... i LỜI CẢM ƠN ........ ii TÓM TẮT......... iii ABSTRACT........... iv LỜI CAM ĐOAN ...... v MỤC LỤC .. vi DANH SÁCH BẢNG.... xii DANH SÁCH HÌNH. xiii TỪ VIẾT TẮT.......... xvi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU. 1 1.1 Đặt vấn đề.... 1 1.2 Mục tiêu đề tài ... 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát ... 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể . 2 1.3 Đối tượng nghiên cứu. 3 1.4 Phạm vi nghiên cứu .... 3 1.5 Nội dung nghiên cứu .. 3 1.6 Đóng góp mới của luận án. 3 1.7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án . 4 1.7.1 Ý nghĩa khoa học.. 4 1.7.2 Ý nghĩa thực tiễn.. 4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..... 5 2.1 Hải miên ..... 5 2.1.1 Phân loại khoa học và phân bố .... 5 2.1.2 Đặc điểm cấu tạo...... 5 2.1.3 Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên .. 7 2.1.3.1 Sự sinh sản vô tính ... 7 vii 2.1.3.2 Sự sinh sản hữu tính . 8 2.1.4 Đa dạng VSV sống cùng với hải miên .... 8 2.1.4.1 Vi khuẩn liên kết với hải miên . 9 2.1.4.2. Nấm và tảo liên kết với hải miên 10 2.1.4.3 VKS liên kết với hải miên .... 10 2.1.4.4 Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên .... 11 2.2 Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria) ... 11 2.2.1 Phân bố của VKS trong tự nhiên... 11 2.2.2 Đặc điểm sinh học của VKS...... 12 2.2.3 Sự hình thành của bào tử VKS.. 13 2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS . 15 2.3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS. 16 2.3.1 Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học ... 16 2.3.2 Phân loại các kháng sinh từ VKS . 17 2.3.3 Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS.. 20 2.3.4 Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp. có nguồn gốc từ biển. . 34 2.4 Một số VSV gây bệnh. 45 2.4.1 Vi khuẩn Bacillus cereus...... 45 2.4.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ...... 45 2.4.3 Vi khuẩn Escherichia coli.... 45 2.4.4 Vi khuẩn Salmonella.... 46 2.4.5 Nấm Candida albicans. 46 2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.. 46 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 49 3.2 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 49 3.2.1 Nguyên vật liệu. 49 3.2.2 Thiết bị - dụng cụ.................................................................................. 49 viii 3.2.3 Hóa chất - môi trường . 50 3.3 Phương pháp nghiên cứu... 51 3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu.. 51 3.3.2 Phân lập và nuôi cấy VKS............ 51 3.2.2.1 Mục tiêu thí nghiệm.. 51 3.3.2.2 Sơ đồ quy trìn h phân lập VKS từ hải miên................................... 52 3.3.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm 52 3.3.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi. 52 3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn.. 54 3.3.3.1 Mục tiêu thí nghiệm.. 54 3.3.3.2 Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn.......................... 54 3.3.3.3 Các bước tiến hành thí nghiệm .. 55 3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 56 3.3.3.5 Phân tích kết quả 56 3.3.4 Nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử ............... 56 3.3.4.1 Mục tiêu thí nghiệm.. 56 3.3.4.2 Các bước tiến hành thí nghiệm .. 56 3.3.4.3 Phân tích kết quả.... 59 3.3.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS. 59 3.3.5.1 Mục tiêu thí nghiệm.. 59 3.3.5.2 Các bước tiến hành thí nghiệm . 59 3.3.5.3 Phân tích kết quả... 61 3.3.6 Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng được tuyển chọn................ 62 3.3.6.1 Mục tiêu thí nghiệm... 62 3.3.6.2 Chuẩn bị dịch nuôi cấy VKS. ................ 62 3.3.6.3 Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy VKS với ethyl acetate. ...... 62 3.3.6.4 Phương pháp sắc ký cột 64 3.3.6.5 Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .... 66 ix 3.3.6.6 Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) .. 67 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...... 68 4.1 Các dòng VKS phân lập được từ hải miên .. 68 4.1.1 Số lượng, nguồn gốc các dòng VKS phân lập được... .. 68 4.1.2 Đặc điểm các dòng VKS phân lập được .. 69 4.1.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng VKS phân lập được 70 4.1.2.2 Đặc điểm tế bào của các dòng VKS phân lập được .. 73 4.2 Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS phân lập được ... 75 4.3 Tuyển chọn và định danh các dòng VKS phân lập được ....... 82 4.4 Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng VKS................. 87 4.5 Chất kháng khuẩn được sinh ra từ VKS. ... 90 4.5.1 Chất kháng khuẩn từ S. tateyamensis ND1.7a. 91 4.5.1.1 Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) . .... 91 4.5.1.2 Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) .. 93 4.5.2 Chất kháng khuẩn từ M. tumbae ND2.7c . 96 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...... 104 5.1 Kết luận... 104 5.2 Đề xuất.... 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO.... 106 PHỤ LỤC...... I Phụ lục 1: Một số hình của thí nghiệm. . I Phụ lục 1.1: Hình ảnh thu mẫu h ải miên... I Phụ lục 1.2: Hình một số mẫu hải miên thu tại các địa điểm II Phụ lục 2: Ký hiệu, nguồn gốc các dòng VKS phân lập III Phụ lục 3: Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng VKS... IX Phụ lục 4: Kết quả đo vòng kháng khuẩn của các dòng VKS đối với các VSV thử nghiệm (mm) .... XV Phụ lục 5: Kết quả định danh 23 VKS tuyển chọn... XXI Phụ lục 5.1: Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp xmồi SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19 của 23 dòng VKS tuyển chọn.. XXI Phụ lục 5.2: Trình tự đoạn gen và kết quả so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của 23 dòng VKS được tuyển chọn... XXI Phụ lục 5.3: Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn XXXIII Phụ lục 6: Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở 23 dòng VKS tuyển chọn. XXXV Phụ lục 6.1: Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A3F/A7R nhân bản cho gen NRPS (700–800 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn. XXXV Phụ lục 6.2: Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi K1F/M6R nhân bản cho gen PKS-I (1.200–1.400 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn. XXXV Phụ lục 6.3: Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR nhân bản cho gen PKS-II (600 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn XXXVI Phụ lục 7: Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của chất được tinh sạnh từ S. tateyamensis ND1.7a... XXXVII Phụ lục 7.1: Phổ MS của hợp chất ND1.7a XXXVII Phụ lục 7.2: Phổ proton của hợp chất ND1.7a XXXVIII Phụ lục 7.3: Phổ carbon 13 của hợp chất ND1.7a XXXIX Phụ lục 7.4: Phổ DEPT của hợp chất ND1.7a XL Phụ lục 7.5: Phổ HSQC của hợp chất ND1.7a XLI Phụ lục 7.6: Phổ HMBC của hợp chất ND1.7a XLII Phụ lục 8: Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS S. tateyamensis ND1.7a.. XLIII Phụ lục 8.1: Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S. tateyamensis ND1.7a phân đoạn hexane-acetone. XLIII Phụ lục 8.2: Phổ MS hợp chất 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl ở phút 4,64... XLIII Phụ lục 8.3: Phổ MS hợp chất cyclohexasiloxane, dodecamethyl ở phút 13,15..... XLIV Phụ lục 8.4: Phổ MS hợp chất cycloheptasiloxane, tetradecamethyl ở phút xi 15,803.. XLV Phụ lục 8.5: Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S. tateyamensis ND1.7a phân đoạn acetone-methanol.. XLV Phụ lục 8.6: Phổ MS hợp chất oxime-, methoxy-phenyl ở phút 5,09 XLVI Phụ lục 8.7: Phổ MS hợp chất hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester ở phút 30,82. XLVI Phụ lục 8.8: Phổ MS hợp chất diisooctyl phthalate ở phút 33,07. XLVI Phụ lục 9: Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS M. tumbae ND2.7c.. XLVII Phụ lục 9.1: Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M. tumbae ND2.7c (mẫu 0,1 ppm) .... XLVII Phụ lục 9.2: Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M. tumbae ND2.7c (mẫu 1 ppm) ... LIV Phụ lục 9.3: Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M. tumbae ND2.7c (mẫu 10 ppm) ... LXXVII Phụ lục 9.4: Phổ GC-MS của dung môi acetone.. XCVIII Phụ lục 9.5: Bảng tổng hợp kết quả giải phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M. tumbae ND2.7c (mẫu 0,1 ppm) .. CI Phụ lục 10: Kết quả phân tích thống kê... CIV Phụ lục 10.1: Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của các dòng VKS phân lập với các VSV thử nghiệm..... CIV Phụ lục 10.2: Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của 23 dòng VKS được tuyển chọn với các VSV thử nghiệm.... CXIV xii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Một số hợp chất mới sản xuất từ VKS biển.. 20 Bảng 3.1: Thành phần cho 1 lít môi trường Starch Casein Agar (SCA) ... 50 Bảng 3.2: Thành phần cho 1 lít môi trường Luria Bertani (LB) . 50 Bảng 3.3: Thành phần cho 1 lít môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA). . 51 Bảng 3.4: Quy ước khả năng kháng khuẩn (Galindo, 2004) 56 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi SC-Act- 0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19.. 58 Bảng 3.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi K1F/M6R . 60 Bảng 3.7: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi KSαF/ KSαR. 60 Bảng 3.8: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với cặp mồi A3F/A7R 61 Bảng 3.9: Chương trình nhiệt độ phân tích GC-MS 67 Bảng 4.1: Thống kê số lượng mẫu hải miên và số lượng các dòng VKS phân lập được theo địa điểm thu mẫu 68 Bảng 4.2: Khả năng kháng các dòng VSV thử nghiệm .. 75 Bảng 4.3: Khả năng kháng khuẩn của 23 dòng VKS 83 Bảng 4.4: Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn 84 Bảng 4.5: Sự hiện hiện các gen NRPS, PKS-I và PKS-II của 23 dòng VKS. 88 Bảng 4.6: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ND1.7a và thymine 92 Bảng 4.7: Thành phần các chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn hexane- acetone.. 94 Bảng 4.8: Thành phần các chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn acetone - methanol 95 Bảng 4.9: Thành phần các chất có hoạt tính sinh học từ VKS M. tumbae ND2.7c (nồng độ 0,1 ppm) .. 99 xiii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Các dạng hải miên hóa thạch 6 Hình 2.2: Một số mẫu hải miên thu tại vùng biển Hà Tiên 7 Hình 2.3: Các con đường (cơ chế) khác nhau tham gia vào quá trình trao đổi chất thứ cấp của VKS.. 16 Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của một số hợp chất thứ cấp sản xuất bởi VKS biển 22 Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của abyssomicin C, bonactin, chlorinated dihydroquinones, diazepinomicin, frigocyclinone và essramycin...... 23 Hình 2.6: Cấu trúc phân tử của lynamicins, marinopyrroles, caboxamycin, himalomycin A và himalomycin B 24 Hình 2.7: Cấu trúc phân tử của glyciapyrroles A, glyciapyrroles B, glyciapyrroles C, tirandamycin C, bisanthraquinone và chandrananimycin A. 25 Hình 2.8: Cấu trúc phân tử của N-(2-hydroxyphenyl)-2-phenazinamine (NHP), salinosporamide A, caprolactones, chinik