Luận án Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa hoc Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP Cần Thơ, 2015 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy GS. TS Cao Ngọc Điệp, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, hướng dẫn cách tiếp cận với các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên và chia sẻ để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn ii TÓM TẮT Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, với nền sản xuất chủ yếu là nông nghiệp trong đó lúa là cây lương thực chính. Nhu cầu phân bón đối với cây lúa là rất lớn, nhưng trong đất trồng lúa ở tỉnh Phú Yên chất dinh dưỡng không cao, song do ý thức và trình độ canh tác của người dân còn thấp. Do vậy để cải thiện năng suất lúa người dân đã lạm dụng phân bón hóa học đã hưởng đến hiệu quả kinh tế và tác động bất lợi đối với môi trường. Vì vậy đề tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao và đặc biệt là những dòng vi khuẩn này có thể thích nghi tốt với điều kiều thổ nhưỡng và thời tiết ở khu vực tỉnh Phú Yên. Các dòng vi khuẩn tuyển chọn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. Trong 3 loại môi trường phân lập chuyên biệt đã chọn được 593 dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, có màu sắc khác nhau: vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục và trắng trong. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên và nhô, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi p515FPL và p13B đã xác định được 556 dòng vi khuẩn là vi khuẩn nội sinh cây lúa. Các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP hoặc trên môi trường phân lập và xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan bằng phương pháp so màu. Kết quả cho thấy có 533 dòng có khả năng cố định đạm, trong số đó 457 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Trong số đó 90 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá cao được phân tích vùng tự gen 16S rDNA. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn được định danh có mức tương đồng 97% trở lên so với các dòng vi khuẩn nội sinh trên ngân hàng gen. 90 dòng vi khuẩn thuộc trong 5 nhóm: Alphaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 11,11%), Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%), Bacteroidetes (chiếm tỉ lệ 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%). Trong số 90 dòng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao đã chọn được 22 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây lúa được trồng trong ống nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân cung cấp cho cây lúa được trồng trong điều kiện nhà lưới thì có 8/22 dòng vi khuẩn có khả năng giúp giảm lượng phân đạm vô cơ cung cấp từ 25% - 75% N (tương đương với 30 kg N - 90 kg N/ha) và 4/8 dòng vi khuẩn có khả năng làm giảm lượng lân vô cơ cung cấp là 50% P (tương đương với 40 kg P2O5/ha) cho cây lúa. Trong thí iii nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (tương đương 60 kg N/ha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan thành dễ tan để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển cho cây lúa và đã tiết kiệm được 50% lượng phân lân vô cơ (tương đương 40 kg P2O5/ha) nhưng vẫn đảm bảo về năng suất, cải thiện chất lượng gạo. Kết quả bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 lên cây lúa trồng ở 2 địa điểm khác nhau tại Phú Yên đều cho hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan cao hơn khi bổ sung riêng rẽ từng dòng cho cây lúa. Sự kết hợp 2 dòng SHL70 và TAL4 giúp giảm 50% N (tương đương 60 kg N/ha) và 50% P (tương đương 40 kg P2O5/ha) trong sản xuất lúa mà vẫn đảm bảo được năng suất lúa tốt. Từ khóa: Cố định đạm, hòa tan lân, lúa cao sản, Phú Yên, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. iv ABSTRACT Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” Phu Yen province is located in coastal of Central Vietnam and rice is main crop. Due to low soil fertility, big amount of chemical fertilizers are used for rice production but low ecomomical effect and this may cause environmental pollution and negatively influence human health. Besides that, endophytic bacteria are microorganisms that live in plant tissues and they may be responsible for the supply of biologically fixed nitrogen to their host plant and plant promoting growth such as phosphate solubilization and IAA biosynthesis. Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” was conducted to isolate and select rice endophytes with good characteristics such as high nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA production to produce biofertilizer for rice cultivation in soils of Phu Yen province in the future. Five hundreds and ninety-three of bacterial isolates were isolated from stems and roots of rice samples which were collected from seven districts and Tuy Hoa city in three kinds of medium (LGI, NFb, RMR). Their colonies had round-shape, climy, smooth, colourless or milk-color, yellow and some colonies appeared in much larger size. Using 16S rRNA gene fragments amplified with DNA using eubacterial universal primers (p515FPL and p13B), 556 isolates were identified as endophytic bacteria. A total of 533 endophytic isolates had the ability of nitrogen fixation, in which 457/533 isolates have ability of phosphate solubilization together with IAA biosynthesis. The sequences of selected endophytic bacteria (90 isolates) showed high degrees of similarity to those of the GenBank references strains (between 97% and 99%). From 90 isolates, 27,78% isolates belonged to Bacilli, 1,11% isolates was Alphaproteobacteria, 11,11% isolates were identified as Betaproteobacteria and 53,33% isolates were Gammaproteobacteria, while 6,67% isolates were Bacteroides. Total 22/90 endophytes having high ability of nitrogen fixation and phosphate solubilization were selected from the in-vitro experiments and 8/22 endophytes which could provides from 25% to 75% N and 4/8 endophytes solubilized 50% P2O5 for rice plants in pot experiments. From field experiments, two strains (Azospirillum amazonense SHL70 and Burkholderia vietnamiensis PHL87) fixed and provided 50% of biological nitrogen for rice plants and two strains (Pseudomonas putida TAL1 and Bacillus subtilis TAL4) solubilized and provided 50% P2O5 requirement of v rice cultivation. The effect of Azospirillum amazonense SHL70 and Bacillus subtilis TAL4 in rice cultivated on soils of two sites (Dong Hoa and Tuy An districts, Phu Yen province) showed that either SHL70, TAL4 or mixture of SHL70 and TAL4 saved 50% N and 50% P2O5 in rice cultivation but grain yield of inoculated rice seeds as same as control treatment 100% N and 100% P2O5 without inoculation. Keywords: endophytic bacteria, high-yielding rice, IAA biosynthesis, nitrogen fixation, phosphate solubilization, Phu Yen. vi Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” là của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nghiên cứu sinh Văn Thị Phương Như vii MỤC LỤC TÓM TẮT ......................................................................................................... ii ABSTRACT ..................................................................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... xi DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xvi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ........................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu .................................................................................................... 2 1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 3 1.5. Những đóng góp mới của luận án ............................................................. 3 1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án .................................. 3 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 5 2.1. Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên ............... 5 2.1.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên ..................................................... 5 2.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở tỉnh Phú Yên .................................................. 6 2.2. Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên ............................ 7 2.2.1. Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu suất sử dụng phân bón hóa học ....................................................................... 7 2.2.1.1. Ở Việt Nam ......................................................................................... 7 2.2.1.2. Ở Phú Yên ........................................................................................... 8 2.2.1.3. Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân làm tổn thất lượng phân bón ............................................................................ 9 2.2.2. Phân bón hữu cơ .................................................................................. 11 2.2.3. Phân hữu cơ - vi sinh ........................................................................... 12 2.2.4. Phân vi sinh .......................................................................................... 12 2.2.4.1. Khái niệm phân vi sinh ..................................................................... 12 2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam ........................ 12 2.3. Vai trò của phân bón đối với cây lúa ...................................................... 15 2.3.1. Vai trò của phân đạm đối với cây lúa .................................................. 15 2.3.2. Vai trò của phân lân đối với cây lúa .................................................... 15 2.3.3. Vai trò của phân kali đối với cây lúa ................................................... 16 2.4. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh .............................................................. 16 2.4.1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật .................................................. 17 2.4.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa .................................................... 20 2.4.3. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa ........................... 22 viii 2.4.4. Vai trò của vi khuẩn nội sinh ............................................................... 24 2.4.4.1. Khả năng cố định đạm ...................................................................... 24 2.4.4.2. Khả năng hòa tan lân khó tan ........................................................... 26 2.4.4.3. Khả năng tổng hợp IAA .................................................................... 28 2.4.4.4. Đối kháng sinh học ........................................................................... 29 2.4.5. Những nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong sản xuất phân vi sinh ............................................................................................ 31 2.4.5.1. Phân vi sinh cố định đạm .................................................................. 31 2.4.5.2. Phân vi sinh hòa tan lân khó tan ....................................................... 33 2.4.5.3. Phân vi sinh kích thích, điều hoà sinh trưởng thực vật ..................... 35 2.4.5.4. Phân vi sinh đa chức năng ................................................................ 35 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 37 3.1. Phương tiện nghiên cứu .......................................................................... 37 3.1.1. Vật liệu ................................................................................................. 37 3.1.2. Dụng cụ ................................................................................................ 37 3.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 37 3.1.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ........................... 38 3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 41 3.2.1. Thu mẫu lúa ......................................................................................... 42 3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa ...................................................... 43 3.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn. ................. 44 3.2.4. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ................................. 45 3.2.5. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa ............................... 46 3.2.6. Tuyển chọn vi khuẩn nội sinh .............................................................. 50 3.2.6.1. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh ................................................................................................ 50 3.2.6.2. Đo lượng Acethylen bị khử ............................................................. 51 3.2.6.3. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa trồng trong ống nghiệm ......................... 53 3.2.6.4. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn .............. 55 3.2.6.5. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong nhà lưới .............................. 55 3.2.6.6. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng ................ 59 3.2.6.7. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi kết hợp 2 dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa ............................................................. 61 3.3. Xử lý số liệu ............................................................................................ 63 ix CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 64 4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên .................................................................................. 64 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn .................................................................... 64 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập ........... 66 4.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ........................................ 69 4.3. Kết quả khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa .................. 69 4.3.1. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn ......... 70 4.3.2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn .. 72 4.3.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn .......... 74 4.4. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp NH4+ cao, hòa tan lân và tổng hợp IAA ....... 76 4.5. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử và nhận diện gen nifH của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .............................................................. 90 4.5.1. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử của các dòng vi khuẩn ........ 90 4.5.2. Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn được tuyển chọn ............... 92 4.6. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm ................................................ 93 4.6.1. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn ..................................... 93 4.6.2. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn .......................... 95 4.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................................................ 98 4.8. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới .................................................. 102 4.8.1. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới ......... 102 4.8.2. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới ........ 114 4.9. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 121 4.9.1. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng .................................................................................................... 121 4.9.2. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ......................................................... 128 4.10. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ..................................................................................................... 135 x 4.10.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới ..... 135 4.10.2. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng ............ 139 4.10.2.1. Hiệu quả cố định đạ