Luận án Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ THÁI THÀNH ĐƯỢC PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG VÙNG RỄ VÀ NỘI SINH CÂY BẮP TRÊN NỀN ĐẤT PHÙ SA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62420201 NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ THÁI THÀNH ĐƯỢC MÃ SỐ NCS: P0916001 PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG VÙNG RỄ VÀ NỘI SINH CÂY BẮP TRÊN NỀN ĐẤT PHÙ SA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP NĂM 2023 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận văn này, với đề tựa là “Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa đồng bằng sông Cửu Long”, do học viên Thái Thành Được thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp. Luận văn đã báo cáo và được Hội đồng chấm luận văn thông qua ngày: . ./../ Thư ký Nghiên cứu sinh (ký tên) (ký tên) Thái Thành Được Người hướng dẫn chính Chủ tịch Hội đồng (ký tên) (ký tên) LỜI CẢM ƠN Tôi thật may mắn và hạnh phúc khi thực hiện luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học dưới sự hướng dẫn của Phó Giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp nguyên là giảng viên cao cấp Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Trường đại học Cần Thơ. Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự động viên quyết liệt, giúp đỡ to lớn và hỗ trợ nhiệt tình thật quý báu của nhiều người. Xin được bày tỏ lòng tri ân chân thành và sâu sắc! Lời cảm ơn đầu tiên xin được gửi đến thầy tôi, PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp. Thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy các phương pháp tiếp cận khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi với tôi trong quá trình học tập. Thầy đã dành rất nhiều thời gian để khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, sự cố gắng không ngừng, không nãn lòng trước những khó khăn, vấp ngã trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn và tri ân sâu sắc đến thầy. Trân trọng cảm ơn thầy PGS. TS. Nguyễn Văn Thành đã chỉ dạy và động viên tôi nên cố gắng học và thực hiện hoàn thành luận án. Xin cảm ơn đến quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức quý báu, phục vụ quá trình nghiên cứu và viết các báo cáo khoa học. Chân thành cảm ơn Tiến sĩ Trương Thị Bích Vân, Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi và hướng dẫn nhiệt tình trong quá trình thủ tục và hồ sơ luận án cũng như thông tin quý giá trong quá trình thực hiện luận án. Xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi chân thành biết ơn Tiến sĩ Huỳnh Văn Tiền đã hỗ trợ và giúp đỡ, động viên tôi tiếp tục thực hiện hoàn thành luận án. Xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Định Thành, Trung tâm kiểm nghiệm và kiểm định giống Bình Đức thuộc công ty Lộc Trời đã tạo điều kiện về máy, thiết bị, phòng thí nghiệm giúp tôi thực hiện luận án. Xin cảm ơn Ông Nguyễn Văn Chánh tại xã Long Khánh B, huyện Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp, Ông Nguyễn Văn Lời tại xã Vĩnh Trường, huyện An Phú tỉnh An Giang đã hỗ trợ đất ruộng triển khai thực hiện các thí nghiệm trồng trong chậu và ngoài đồng. Chân thành cảm ơn các em sinh viên thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã cộng tác trong thời gian thực hiện luận án. Sau cùng xin được cảm ơn cha mẹ, người thân trong gia đình và con tôi Thái An An là nguồn lực rất lớn tiếp sức đến tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc hoàn thành luận án. Chân thành cảm ơn! Thái Thành Được TÓM TẮT Bắp là cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu. Bắp chứa nhiều dinh dưỡng là nguồn thức ăn con người. Bắp là nguồn nguyên liệu công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi. Để tăng năng suất bắp, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân đạm hóa học. Điều này dẫn đến nhiều tác hại như làm thay đổi tính chất lý hóa của đất, giảm độ phì nhiêu, gây ô nhiễm môi trường do sự thất thoát nitrate và gây ảnh hưởng xấu lên hệ sinh thái. Đặc biệt, phân đạm hoá học hiện nay có giá thành rất cao đã làm tăng chi phí sản xuất. Hướng sản xuất nông nghiệp hiện nay là nâng cao độ phì nhiêu của đất, giảm lượng phân hóa học, tăng cường phân sinh học để giảm chi phí sản xuất, giảm ô nhiễm môi trường, góp phần tạo sản phẩm an toàn và phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. Phân bón vi sinh cây bắp từ những dòng vi khuẩn bản địa là giải pháp cần thiết. Do vậy, Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp đã được thực hiện với mục tiêu tìm các chủng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây bắp, có khả năng cố định đạm cao, sản xuất phân vi sinh cho cây bắp trồng vùng ĐBSCL. Từ 190 mẫu cây bắp và 38 mẫu đất thu được từ các địa điểm, 120 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 635 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm đã được phân lập được. Hai mươi chín dòng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên gene 16S rDNA được định danh thuộc về các chi Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas và Enterobacter. Các dòng vi khuẩn tuyển chọn này tổng hợp NH4+ từ 2,51-5,64 (mg/L) và sản xuất IAA cao từ 6,63-26,75 (mg/L). Năm dòng vi khuẩn được tuyển chọn cung cấp đạm tốt nhất cho cây bắp trong môi trường Yoshida không đạm. Năm dòng vi khuẩn AAL1, AMR1, ADR3, DNL14 và DNR5 theo thứ tự có quan hệ gần nhất với các loài: Paenibacillus wenxiniae, Bacillus megaterium, Bacillus aryabhattai, Enterobacter sp, Klebsiella pneumoniae. Thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng khi bắp bón 75% NPK, chủng vi khuẩn dòng ADR3 (Bacillus aryabhattai) hoặc DNR5 (Klebsiella pneumoniae) giúp tăng tỷ lệ nẫy mầm, kích thích sinh trưởng cây bắp và cho năng suất tương đương bón 100% NPK và tiết kiệm được 25% NPK. Từ khóa: Bacillus aryabhattai ADR3, bắp lai NK7328, Klebsiella pneumoniae DNR5, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn nội sinh. ABSTRACT Corn is an important food crop in world economic. Corn has a lot of nutrient that is a good source of food for human. Corn is also a source of industrial material for production animal feed. To have high yield of corn, farmers use a lot of chemical nitrogen fertilizer. This leads to many bad effects such as changing chemical and physical characteristics of soil, decreasing soil fertility, causing environmental pollution because of extra lost of nitrate and affecting ecological conditions. Especially, the price of chemical nitrogen fertilizer is very high made high production cost. Recently, agriculture production based on increasing soil fertility, minimizing chemical fertilizer, increasing bio-fertilizer to decrease production cost, minimizing environmental pollution in order to have safe products ecological and the development of stable agriculture. Bio-fertilizer for corn consisting of indigenous bacteria is an urgent technique. Thus, the study of insolation of nitrogen fixing bateria of the rhizophere and endophytic bacteria of cultivated corn was done to find out good strains of rhizopheric bateria and endophytic bateria which could fix nitrogen well for the production of biofertilizer for corn cultivated in Mekong Delta. From 190 samples of corn plant and 38 soil samples, 120 rhizophere bacterial strains and 635 endophytic bateria strains which could fix nitrogen were isolated. Twenty nine selected strains identified by molecular technique based on 16S rDNA, were similar to Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas, and Enterobacter. These strains could synthesized NH4+ (2.51-5.64 mg/L) and produced high IAA (6.63-26.75 mg/L). Five good strains which could fix high amount of nitrogen for corn were cultured in nitrogen free Yoshida medium. These five bacterial strains, AAL1, AMR1, ADR3, DNL14 and DNR5 have closed relationship with Paenibacillus wenxiniae, Bacillus megaterium, Bacillus aryabhattai, Enterobacter sp and Klebsiella pneumoniae, respectively. Greenhouse and field tests showed that when applied 75% NPK and inoculated corn either with ADR3 (Bacillus aryabhattai) or DNR5 (Klebsiella pneumoniae), the germination rate of corn increased, the growth of corn was stimulated and yield of corn was equivalent to the yield of corn applied 100% of chemical NPK fertifizer and 25% NPK fertilizer were saved. Keywords: Bacillus aryabhattai ADR3, endophytic bacteria, hybrid corn NK7328, Klebsiella pneumoniae DNR5, nitrogen fixing bacteria, rhizopheric bacteria. LỜI CAM ĐOAN Luận án Tiến sĩ, chuyên ngành Công nghệ sinh học, khoá 2016-2020, với công trình nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long”, được nghiên cứu sinh Thái Thành Được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của Phó Giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Bộ môn Công nghệ sinh học Vi sinh vật, Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ, Việt Nam; Liên hiệp các Hội Khoa học và Kỹ thuật thành phố Cần Thơ. Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh Thái Thành Được i MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................ ...i DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. viii CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ...................................................................................... ....1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... ....1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 1.3 Nội dung nghiên cứu.............................................................................................. 2 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 2 1.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 3 1.6 Tính cấp thiết, đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ...... 3 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5 2.1 Điều kiện tự nhiên của Đồng bằng sông Cửu Long ............................................ 5 2.2 Đặc điểm đất phù sa, diện tích trồng và năng suất bắp ở ĐBSCL .................. 6 2.2.1 Đặc điểm đất phù sa ............................................................................................. 6 2.2.2 Diện tích đất trồng và năng suất bắp .................................................................... 6 2.3 Sơ lược về cây bắp ...................................................................................................................... 7 2.3.1 Phân loại, nguồn gốc ................................................................................................................ 7 2.3.2 Đặc điểm sinh thái ................................................................................................ 7 2.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng của cây bắp ......................................................................... 8 2.3.4 Giá trị cây bắp ............................................................................................................................ 9 2.3.5 Đặc điểm giống bắp NK 7328 ............................................................................... 9 2.3.6 Kỹ thuật trồng bắp cơ bản .................................................................................... 9 2.4 Tổng quan về vi khuẩn cố định đạm ................................................................................... 10 2.4.1 Chu trình nitơ và định nghĩa vi khuẩn cố định đạm ............................................................. 10 2.4.2 Quá trình cố định đạm ở vi sinh vật ....................................................................................... 11 2.4.3 Vi khuẩn cố định đạm ............................................................................................................. 15 2.4.4 Cơ chế xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn .......................................... 22 2.5 Đặc điểm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh và vai trò đối với thực vật ................... 25 2.5.1 Vi khuẩn đất vùng rễ ở thực vật ......................................................................... 25 2.5.2 Vi khuẩn nội sinh ở thực vật .............................................................................. 25 2.5.3 Vai trò của vi khuẩn đối với thực vật ................................................................. 26 2.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền của các vi khuẩn ............................................................... 28 2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật ..................................................................................28 2.6.2 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền dựa vào đoạn gene 16S rDNA ............ 28 2.6.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đoạn gene NifH ......................................... 29 2.7 Hiện trạng sử dụng phân bón cho cây bắp ở ĐBSCL ...................................... 32 2.7.1 Phân bón hoá học ............................................................................................... 32 2.7.2 Phân bón vi sinh ................................................................................................. 35 ii 2.8 Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn cố định đạm ..................................................................... 35 2.8.1 Các nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm ............................................................................. 35 2.8.2 Thành tựu ứng dụng phân vi sinh vật trong nông nghiệp ................................... 37 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 38 3.1 Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................... 38 3.1.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................................38 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 38 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm, dụng cụ và hoá chất ........................................................... 39 3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 40 3.2.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có khả năng cố định đạm trong đất vùng rễ và nội sinh cây bắp trồng tại ĐBSCL .................................................... 41 3.2.2 Nội dung 2: Tuyển chọn 1 số dòng vi khuẩn cố định đạm và IAA cao ............. 45 3.2.3 Nội dung 3: Nhân gene 16S rDNA và đánh giá tương đồng với cơ sở dữ liệu gene vi khuẩn NCBI ............................................................................... 48 3.2.4 Nội dung 4: Khảo sát đa dạng di truyền dựa vào gene NifH của một số dòng vi khuẩn cố định đạm cao ......................................................................... 51 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả 8 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA lên khả năng nẩy mầm và sinh trưởng cây bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm ............................................................................... 53 3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn đối với cây bắp 30 NSG trong điều kiện nhà lưới ........................................................................ 56 3.2.7 Nội dung 7: Hiệu quả 2 dòng vi khuẩn đến cây bắp trồng trong chậu ............... 59 3.2.8 Nội dung 8: Hiệu quả 2 dòng vi khuẩn đến cây bắp trồng ngoài đồng .............. 62 3.3 Phương pháp xử lý số liệu ...........................................................................................65 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 66 4.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có khả năng cố định đạm trong đất vùng rễ và nội sinh cây bắp trồng tại ĐBSCL ......................................... 66 4.1.1 Kết quả thu mẫu đất vùng rễ và cây bắp ............................................................................ 66 4.1.2 Kết quả phân tích pH mẫu đất ............................................................................ 66 4.1.3 Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm ............................................................. 68 4.2 Nội dung 2: Tuyển chọn 1 số dòng vi khuẩn cố định đạm và IAA cao........... 78 4.2.1 Kiểm tra khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn ..................................... 78 4.2.2 Kiểm tra sinh tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm cao ............... 80 4.2.3 Đặc tính cố định đạm và tổng hợp IAA cao của 29 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh được tuyển chọn ........................................................... 82 4.3 Nội dung 3: Nhân gene 16S rDNA và đánh giá tương đồng với cơ sở dữ liệu gene vi khuẩn NCBI ..................................................................................... 85 4.3.1 Kết quả khuếch đại gene 16S r DNA của 29 dòng vi khuẩn .............................. 86 4.3.2 Kết quả dò tìm dòng tương đồng trình tự gene 16S rRNA trên NCBI .............. 86 4.3.3. Đa dạng di truyền gene 16S rRNA của 6 dòng vi khuẩn đất vùng rễ ............... 88 iii 4.3.4 Đa dạng di truyền gene 16S rRNA của 23 dòng vi khuẩn nội sinh ................... 90 4.3.5 Đa dạng di truyền gene 16S rRNA của 29 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây bắp ................................................................................ 91 4.4 Nội dung 4: Khảo sát đa dạng di truyền dựa vào gene NifH của một số dòng vi khuẩn cố định đạm cao ........................................................... 95 4.4.1 Khuếch đại gene NifH của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn .................................... 95 4.4.2 Giải trình tự gene NifH của 2 dòng vi khuẩn...................................................... 95 4.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả 8 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA lên khả năng nẩy mầm và sinh trưởng cây bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................... 98 4.5.1 Ảnh hưởng mật số của 8 dòng vi khuẩn đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt bắp ........... 98 4.5.2 Khả năng kích thích nẩy mầm hạt bắp của 8 dòng vi khuẩn ở mật số 108CFU/mL ....................................................................................................... 100 4.5.3 Khảo sát 8 dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng đến cây bắp trồng trong phòng thí nghiệm ..................................................................................... 101 4.5.4 Đánh giá khả năng sống sót của 5 dòng vi khuẩn trong chất mang ................. 103 4.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn đối với cây bắp 30 NSG trong điều kiện nhà lưới ................................................................... 104 4.6.1 Vụ 1 (04/05/2018-03/06/2018) ......................................................................... 104 4.6.2 Vụ 2 (08/06/2018-08/07/2018) ............................................................