Luận án Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ UYỂN THANH PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG (Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 62420201 NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ UYỂNTHANH MÃ SỐ NCS: P0915008 PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG (Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN TS. NGUYỄN ĐỨC ĐỘ TS. TRẦN ĐÌNH GIỎI NĂM 2022 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh đồng tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh”, do nghiên cứu sinh Lê Uyển Thanh thực hiện theo sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Đức Độ và TS. Trần Đình Giỏi. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: / / . Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại. Thư Ký Người hướng dẫn 1 Người hướng dẫn 2 Chủ tịch Hội đồng TS. Trương Thị Bích Vân TS. Nguyễn Đức Độ TS. Trần Đình Giỏi PGS.TS. Nguyễn Văn Thành iLỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Khoa Sau Đại học, khoa Nông nghiệp, phòng Đào tạo, phòng Quản lý Khoa học và các phòng ban chức năng khác của trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Đức Độ và TS. Trần Đình Giỏi đã tận tình hướng dẫn, luôn đồng hành, hỗ trợ và động viên tôi hoàn thành luận án này. Cảm ơn Quý Thầy, Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Cần Thơ, Bộ môn Bảo vệ Thực vật - Khoa Nông nghiệp trường Đại học Cần Thơ đã truyền dạy kiến thức, động viên, khuyến khích cho tôi trong thời gian học tập nghiên cứu tại trường. Chân thành cảm ơn các anh, chị là học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học đã đồng hành, trao đổi, động viên cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Đặc biệt cảm ơn bạn Tô Lan Phương, em Trần Thanh Tùng, Thị Dim, Nguyễn Hồng Quí, Ngô Thị Hồng Hương đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới các chủ đất canh tác tại huyện Châu Thành và Thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp đã hỗ trợ khu thí nghiệm ngoài đồng ruộng. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành trường Đại học Đồng Tháp, các đồng nghiệp,... đã cho phép, hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các hoạt động giảng dạy, học tập và nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình quan tâm, động viên và hỗ trợ tôi hoàn thành nhiệm vụ trong công tác, học tập và thực hiện luận án. Lê Uyển Thanh ii TÓM TẮT Luận án về “Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh” được thực hiện từ tháng 9 năm 2016 đến tháng 9 năm 2021 dựa trên thực trạng việc lạm dụng thuốc trừ bệnh hoạt chất hóa học đã và đang gây ra những tác động bất lợi, và kiểm soát sinh học đang trở thành biện pháp được quan tâm trong quản lý bệnh hại cây trồng. Với mục đích tìm ra tác nhân sinh học có tiềm năng trong phòng trị bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt, nghiên cứu này đã được thực hiện nhằm hai mục tiêu: (i) Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.); (ii) Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp. gây ra. Luận án đã phân lập được các dòng vi khuẩn gây bệnh, đánh giá khả năng gây hại, xác định được các đặc điểm qua phân tích sinh hóa, kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS và phân tích sinh học phân tử. Kết quả đã ghi nhận dòng Xanthomonas euvesicatoria là tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng qua phân tích MALDI-TOF-MS và MLSA; Trong khi đó, xác định Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt dựa trên đặc điểm sinh hóa. Trên một số dòng vi khuẩn gây bệnh được chọn, hiệu quả đối kháng, kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cơ chất vùng rễ cây hoa hồng, đất vùng rễ trồng cây ớt, và đất vùng sinh thái bản địa được sàng lọc và đánh giá trong điều kiện in vitro, nhà lưới và ngoài đồng. Qua sàng lọc in vitro, kết quả ghi nhận ba dòng BR16, BR37, BR88 (từ cơ chất vùng rễ cây hoa hồng) và ba dòng T265, X61, G24 (từ đất vùng sinh thái bản địa) thể hiện sự đối kháng triển vọng với ba dòng Xanthomonas euvesicatoria (XR13, XR9, XR18) gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng. Đồng thời, ba dòng BP11, BP49, BP103 (từ đất vùng rễ cây ớt) và G24, T11, T188 (từ đất vùng sinh thái bản địa) có khả năng đối kháng triển vọng đối với ba dòng Xanthomonas spp. (XP17, XP7, XP1) gây bệnh trên cây ớt. Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được xác định qua kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS, các dòng BP49, X61 được xác định đến loài B. subtilis, và ghi nhận các dòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 thuộc chi Bacillus, dòng T11 thuộc về chi Enterobacter, dòng X16 thuộc chi Serratia. Một số dòng được tiếp tục xác định qua phân tích sinh học phân tử và đăng ký “accession number” là các loài B. velezensis MW677565 (BR16), B. subtilis MW828613 (BR37), B. amyloliquefaciens MW828656 (BR88), B. velezensis OM017175 (BP103), Paenibacillus elgii MZ841643 (T265), B. subtilis MZ841644 (G24). Ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng, với hiệu quả giảm bệnh, giảm chỉ số bệnh và chỉ số AUDPC cao nhất, B. amyloliquefaciens MW828656 (BR88) và B. velezensis OM017175 (BP103) được ghi nhận hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất trên đối tượng cây chủ tương ứng, và đặc biệt là B. subtilis MZ841644 (G24) phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa đạt hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất trên cả hai loại cây iii chủ. Nhìn chung, nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận B. velezensis (BR16), B. subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp. (BP11, X32), Enterobacter spp. (T11), Serratia spp. (X16) có khả năng đối kháng đáng kể, và đã tuyển chọn được B. amyloliquefaciens BR88, B. velezensis BP103, B. subtilis G24 có khả năng kiểm soát bệnh hiệu quả nhất. Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt. Từ khóa: Đốm lá, Xanthomonas, vi khuẩn đối kháng, cây hoa hồng, cây ớt, hiệu quả kiểm soát. iv ABSTRACT This thesis, with the title of “Isolation of Xanthomonas spp. causing leaf spot on rose (Rosa spp.) and pepper (Capsicum spp.) in Dong Thap province and selection of antagonistic bacteria for prevention and control of these diseases” was carried out from September 2016 to september 2021 based on the fact with the adverse effects caused by the abuse of chemical fungicides, biological control is becoming the preferred method to manage plant diseases. With the aim of finding potential biological agents in the prevention and treatment of bacterial leaf spot on rose and pepper, this study was executed with two objectives: (i) The first was isolation and identification of bacterial strain Xanthomonas spp. causing leaf spot disease on Rosa spp. and Capsicum spp.; (ii) The second was selection of bacterial isolates capable of controlling leaf spot caused by Xanthomonas spp.. In thesis, pathogenic strains were isolated, evaluated for their virulence, and identified through biochemistry, MALDI-TOF-MS analysis and molecular analysis technique. The result show that Xanthomonas euvesicatoria causing the leaf spot on rose. Meanwhile, Xanthomonas spp. causing leaf spot on pepper based on biochemical characteristics. Against some selected pathogenic strains, the antagonistic and disease control effects of isolates from the rhizosphere substrates of rose, rhizosphere soil of pepper, and soil of native ecological area were screened and evaluated under in vitro, net-house and field conditions. Through in vitro screening, three isolates with BR16, BR37, BR88 (from rhizobacteria soil of rose) and three isolates with T265, X61, G24 (from the soil of the native ecological area) showed potential antagonism to Xanthomonas euvesicatoria (XR13, XR9, XR18) which causing leaf spot on rose, and three isolates with BP11, BP49, BP103 (from rhizobacteria soil of pepper) and three isolates with G24, T11, T188 (from the native ecological area) have potential antagonistic ability against Xanthomonas spp. (XP17, XP7, XP1) which causing leaf spot on pepper. Potential antagonistic isolates are also identified through MALDI-TOF-MS technique, two isolates of BP49, X61 were identified belong to B. subtilis, and the other isolates (BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24) are belong to Bacillus genus, the T11 isolate belongs to Enterobacter genus, and X16 isolate belongs to Serratia genus. Identifying by molecular technique and depositing “accession number” as B. velezensis MW677565 (BR16), B. subtilis MW828613 (BR37), B. amyloliquefaciens MW828656 (BR88), B. velezensis OM017175 (BP103), Paenibacillus elgii MZ841643 (T265), B. subtilis MZ841644 (G24) were performed. In the net-house and field conditions, with the highest efficiency in disease reduction, severity index reduction and AUDPC index, B. amyloliquefaciens MW828656 (BR88) and B. velezensis OM017175 (BP103), showed the highest disease control effects on the host plant, respectively. Especially, B. subtilis MZ841644 (G24) achieved the disease control efficiency on both host plants. In general, the thesis recorded Xanthomonas axonopodis causing leaf spot on rose and vXanthomonas spp. causing leaf spot on pepper. Besides, B. velezensis (BR16), B. subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp. (BP11, X32), Enterobacter spp. (T11), Serratia spp. (X16) get potential antagonistic ability, and B. amyloliquefaciens BR88, B. velezensis BP103, B. subtilis G24 with the most effective disease control ability were selected. These isolates can be used as biological agents for the prevention and control of the leaf spot disease on rose and pepper. Keywords: Leaf spot, Xanthomonas, antagonistic bacteria, rose, pepper, control efficiency. vi CAM ĐOAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà chính tôi cùng với ThS. Tô Lan Phương đã thực hiện và nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Đức Độ và TS. Trần Đình Giỏi. Tất cả các số liệu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu cùng cấp nào khác. Cán bộ hướng dẫn 1 Cán bộ hướng dẫn 2 Tác giả luận án TS. Nguyễn Đức Độ TS. Trần Đình Giỏi Lê Uyển Thanh iMỤC LỤC Tóm tắt................................................................................................................... ii Abstract .................................................................................................................. iv Chương 1: Đặt vấn đề .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu của luận án ............................................................................................ 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.4 Tính mới của luận án ........................................................................................... 2 1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 2 1.5.1 Phạm vi nghiên cứu........................................................................................... 2 1.5.2 Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 3 1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................. 3 1.6.1 Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 3 1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 3 Chương 2: Tổng quan tài liệu ................................................................................. 4 2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật ............................................ 4 2.1.1 Tác nhân gây bệnh ............................................................................................ 4 2.1.2 Triệu chứng bệnh .............................................................................................. 5 2.1.3 Quản lý bệnh ..................................................................................................... 5 2.2 Sơ lược về cây hoa hồng và cây ớt ...................................................................... 6 2.2.1 Cây hoa hồng .................................................................................................... 6 2.2.2 Cây ớt ............................................................................................................... 7 2.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp ................... 7 2.3.1 Tương tác của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp ................... 7 2.3.2 Cộng đồng vi khuẩn trong đất ngập nước .......................................................... 9 2.4 Một số cơ chế kiểm soát bệnh thực vật của các dòng vi khuẩn từ đất .................. 12 2.5 Các nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh đốm lá do Xanthomonas sp. trên hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt ..................................................................... 12 2.5.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng .................................................... 12 2.5.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt ............................................................... 16 2.6 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát mầm bệnh do Xanthomonas spp. gây ra trên cây trồng ......................................................... 18 ii 2.6.1 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas citri subsp. citri trên cây có múi .................................................. 19 2.6.2 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv. campestris trên cây trồng họ cải........................... 20 2.6.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv. campestris trên cây cà chua và ớt ......................... 22 2.6.4 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát các loài Xanthomonas spp. khác ..................................................................................... 23 2.6.5 Kỹ thuật MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desraction Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry) và MLSA (Multilocus sequence analysis) trong nghiên cứu định danh vi khuẩn ................................................................................................................ 24 Chương 3: Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 28 3.1 Vật liệu ................................................................................................................ 28 3.1.1 Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 28 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và Môi trường nuôi cấy .......................................................... 28 3.1.3 Mẫu bệnh cây .................................................................................................... 29 3.1.4 Vật liệu thí nghiệm............................................................................................ 29 3.1.4.1 Giống cây ....................................................................................................... 29 3.1.4.2 Mẫu cơ chất hoặc đất ..................................................................................... 29 3.1.4.3 Vật liệu trồng cây ........................................................................................... 30 3.2 Phương pháp ........................................................................................................ 30 3.2.1 Nội dung 1: Phân lập và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt ..................................................... 32 3.2.1.1 Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng chuyên canh các loại cây trồng đã được chọn tại tỉnh Đồng Tháp ......................................................... 32 3.2.1.2 Phân lập, tách ròng vi khuẩn Xanthomonas spp. từ các mẫu bệnh .................. 32 3.2.1.3 Khảo sát khả năng gây bệnh trên các cây trồng đã chọn của các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh ................................................................. 33 3.2.1.4 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. dựa vào hình thái và phương pháp sinh hóa ........................................................................ 35 3.2.1.5 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. theo phương pháp MALDI-TOF-MS ................................................................................. 36 iii 3.2.1.6 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA).......................................................................................................... 37 3.2.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. gây bệnh đã được phân lập ................................................... 39 3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất thu được ........................................................... 39 3.2.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro trước các dòng Xanthomonas spp. được chọn của những dòng vi khuẩn phân lập được từ mẫu đất ....................................................................................... 40 3.2.2.3 Định danh một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng ................................... 42 3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng ........................... 43 3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh (BCA) ở điều kiện ngoài đồng ........................................................... 46 3.2.5 Phương pháp lây nhiễm bệnh ............................................................................ 47 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................. 47 Chương 4: Kết quả và thảo luận ............................................................................. 48 4.1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn ..................... 48 4.1.1 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng tại tỉnh Đồng Tháp ............................................................................. 48 4.1.1.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp. gây bệnh trên cây hoa hồng ....................... 48 4.1.1.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây hoa hồng của các dòng Xanthomonas spp. được phân lập .................................................................. 48 4.1.1.3. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo phương pháp MALDI-TOF-MS .................................................................... 54 4.1.1.4. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm