Luận án Sán lá phổi paragonimus heterotremus và paragonimus westermani ở Việt Nam: Hình thái, phân tử, sinh học và chẩn đoán miễn dịch

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LƢU ANH TÚ SÁN LÁ PHỔI Paragonimus heterotremus VÀ Paragonimus westermani Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ, SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2018 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LƢU ANH TÚ SÁN LÁ PHỔI Paragonimus heterotremus VÀ Paragonimus westermani Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI, PHÂN TỬ, SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Ký sinh trùng học Mã số: 62.42.01.05 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Phạm Ngọc Doanh 2. TS. Bùi Khánh Linh Hà Nội – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được sử dụng trong luận án nào khác. Hà Nội, ngày 2 tháng 3 năm 2018 Tác giả ii LỜI CẢM Ơ N Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc Doanh và TS. Bùi Khánh Linh - giảng viên hướng dẫn khoa học, đã tạo điều kiện tối đa và truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài và viết luận án, đồng thời luôn động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin trân trọng cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho 2 đề tài mã số 106.12-2012.52 và 106-NN.05- 2016.17 để tôi được thực hiện các nội dung nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Học Viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Phòng Quản lý tổng hợp, cùng các thầy cô trong Viện Sinh thái và TNSV đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Hoàng Văn Hiền cùng tập thể cán bộ Phòng Ký sinh trùng học, Viện Sinh thái và TNSV đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện các thí nghiệm. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Trung ương đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn vợ và các con của tôi đã cho tôi thêm sức mạnh, động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn. Hà Nội, ngày 2 tháng 3 năm 2018 Tác giả iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ/nghĩa tiếng Việt CO1 Cytochrome c oxidase subunit mitochondrial gene Gien ty thể CO1 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết enzym dot-ELISA dot-ELISA ELISA điểm trên giấy DNA Deoxyribonucleic acid ITS2 Internal transcribed spacer 2 Đoạn chèn hệ gen nhân ITS2 16S rDNA 16S ribosomal DNA/ Gien ty thể 16S PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuyếch đại gien MC Metacercaria LC Lào Cai YB Yên Bái QT Quảng Trị SLP Sán lá phổi iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ iii MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH...................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 4 1.1. Khái quát chung về sán lá phổi ................................................................................ 4 1.1.1. Lịch sử phát hiện, hình thái, cấu tạo và phân loại sán lá phổi ............................ 4 1.1.2. Vòng đời phát triển của sán lá phổi .......................................................................... 8 1.1.3. Dịch tễ học bệnh sán lá phổi .................................................................................... 11 1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và tổn thương bệnh sán lá phổi ............................................ 13 1.1.5. Chẩn đoán bệnh sán lá phổi .................................................................................... 14 Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA): ....................................................... 16 1.1.6. Điều trị bệnh sán lá phổi .......................................................................................... 17 1.1.7. Phòng bệnh sán lá phổi ............................................................................................ 18 1.2. ........... Tình hình nghiên cứu hai loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani trên thế giới ......................................................................................................... 19 1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus ................................................ 19 1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani ................................................... 20 1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi và bệnh sán lá phổi ở Việt Nam ..................... 21 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 25 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 25 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................................... 25 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................. 25 2.1.4. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................... 26 2.2. Phương pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm ..................................................................... 26 v 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 27 2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của sán lá phổi ......................................................... 27 2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở cua suối tại địa điểm nghiên cứu....................................................................................................................................... 29 2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria .................................................................................. 29 2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử của loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani .............................................................................................................. 30 2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chính .................................................................................. 31 2.3.6. Nghiên cứu hình thái sán lá phổi trưởng thành .................................................. 31 2.3.7. Xác định vai trò vật chủ chứa .................................................................................. 32 2.3.8. Xác định vật chủ ngoài tự nhiên của sán lá phổi ................................................. 32 2.3.9. Nghiên cứu sức sống của metacercaria ................................................................. 35 2.3.10. Nghiên cứu phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi ........................ 36 2.3.10.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ..................................................................................... 36 2.3.10.2. Quy trình thực hiện dot-ELISA .............................................................................. 36 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 40 3.1. Kết quả xác định phương pháp xét nghiệm cua và điều tra tình hình nhiễm metacercaria ở cua suối tại các địa điểm nghiên cứu ........................................................... 40 3.1.1. Xác định phương pháp xét nghiệm cua tìm metacercaria sán lá phổi ........................ 40 3.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của sán lá phổi ............... 47 3.2.1. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. westermani 47 3.2.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của loài P. heterotremus . ...................................................................................................................................... 54 3.3. ............... Một số đặc điểm sinh học của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ....................................................................................................... 59 3.3.1. Vật chủ trung gian thứ nhất .................................................................................... 59 3.3.2. Vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi ................................................................ 69 3.3.3. Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chứa và vật chủ chính ......................... 72 3.3.4. Sức sống của metacercaria sán lá phổi ở các điều kiện khác nhau .................. 81 3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi .................... 85 3.4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ............................................................................. 85 3.4.2. Xác định nồng độ kháng nguyên và thời gian phản ứng ở 37°C ................................. 87 vi 3.4.3. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 20°C ..................................... 88 3.4.4. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 10°C ..................................... 89 3.4.5. Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 4oC .................................................. 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 94 KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 94 1. Phƣơng pháp xét nghiệm cua và tình hình nhiễm metacercaria của sán lá phổi ở cua suối ...................................................................................................................................... 94 2. Đa dạng hình thái và di truyền của Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ................................................................................................................................ 94 3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ..................................................................................................................................................... 94 4. Kỹ thuật dot-ELISA chẩn đoán miễn dịch ................................................................... 95 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................. 95 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................. 97 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................................... 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 99 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Những vẫn đề đã và chưa được giải quyết của 2 loài sán lá phổi Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng để nhân bản trình tự đích nghiên cứu ả g Metacercaria thu được với thời gian lắng cặn khác nhau Bả g So sánh thời gian xét nghiệm ng phương pháp ép và giã-lọc cua ả g So sánh số lượng metacercaria thu được từ 2 phương pháp xét nghiệm cua Bảng 3.4 . Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi ở các địa điểm nghiên cứu Bảng 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối Bảng 3.6. Hình dạng và kích thước các dạng metacercaria của loài P. westermani Bảng 3.7. Sai khác vị trí nucleotide của trình tự gen 16S giữa dạng diploid và triploid P. westermani Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu ốc thu từ Việt Nam so với các loài thuộc giống Gammatricula dựa vào trình tự gen CO1. Bảng 3.9. Kích thước ấu trùng sán lá phổi trong cơ thể ốc Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở ốc tại các địa điểm nghiên cứu Bảng 3.11. Vật chủ ốc của các loài sán lá phổi ở các nước và Việt Nam ả g . Kết quả gây nhiễm metacercaria P. westermani cho chuột bạch ả g . Kích thước metacercaria mới thoát nang và sán non thu từ chuột bạch thí nghiệm sau gây nhiễm 30 ngày Bảng 3.14. Kết quả gây nhiễm P. westermani cho động vật nuôi Bảng 3.15. Kích thước sán thu từ phổi m o sau 170-180 ngày gây nhiễm Bảng 3.16. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30oC) trong nước muối sinh lý Bảng 3.17. Sức sống của metacercaria trong dung dịch nước muối sinh lý tại 4oC ở các mật độ khác nhau Bảng 3.18. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA Bảng 3.19. Thời gian phản ứng ELISA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau viii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình dạng chung của sán lá phổi Paragonimus Hình 1.2. Hình dạng chung của metacercaria sán lá phổi Paragonimus Hình 1.3. Hình dạng chung cercaria của sán lá phổi Paragonimus Hình 1.4. Hình dạng trứng sán lá phổi Paragonimus Hình 1.5. Vòng đời phát triển của loài Paragonimus westermani Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu Hình 2.2. Sơ đồ nội dung nghiên cứu Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ trung gian thứ nhất Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm xác định vật chủ chính Hình 2.5. Chuẩn bị nhỏ huyết thanh đối chứng và kháng nguyên lên giấy nitrocellulose Hình 3.1. Các loài cua suối bắt được ở các địa điểm nghiên cứu Hình 3.2. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Quảng Trị Hình 3.3. Metacercaria sán lá phổi tìm thấy ở cua suối thu tại Yên Bái và Lào Cai Hình 3.4. Paragonimus westermani metacercaria thu từ cua suối bắt tại Yên Bái Hình 3.5. Các dạng P. westermani metacercaria thu từ cua suối tại tỉnh Quảng Trị. Hình 3.6. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên trình tự ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood. Hình 3.7. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. westermani dựa trên trình tự gen 16S được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood. Hình 3.8. Metacercaria loài P. heterotremus thu từ Yên Bái và Lào Cai Hình 3.9. Metacercaria loài P. heterotremus thu từ Quảng Trị Hình 3.10. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên trình tự ITS2 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood. Hình 3.11. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần thể P. heterotremus dựa trên trình tự CO1 được xây dựng b ng phương pháp Maximum Likelihood. Hình 3.12. Ốc nhiễm ấu trùng Microcercaria Hình 3.13. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Quảng Trị tương đồng cao nhất (99%) với loài S. quangtriensis. ix Hình 3.14. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào Cai tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis. Hình 3.15. Trình tự CO1 của loài ốc nhiễm microcercaria thu từ Yên Bái và Lào Cai tương đồng cao nhất (91%) với loài G. fujiansis. Hình 3.16. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài ốc thuộc họ Pomatiopsidae. Hình 3.17. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.1 tại Yên Bái và Lào Cai 100% tương đồng với loài P. heterotremus. Hình 3.18. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc Triculinae gen sp.2 tại Quảng Trị 100% tương đồng với loài P. proliferus. Hình 3.19. Trình tự ITS2 của cercaria thu từ ốc S. quangtriensis tại Quảng Trị 100% tương đồng với loài P. westermani. Hình 3.20. Cercaria (trên) và redia (dưới) của các loài sán lá phổi Hình 3.21. Ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá phổi Hình 3.22. Trứng sán lá phổi Paragonimus sp. (a-c) và sán lá (d) thu từ mẫu phân của mèo rừng tại Quảng Trị Hình 3.23. Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. westermani. Hình 3.24. Trình tự ITS2 của trứng sán lá phổi tương đồng với P. heterotremus. Hình 3.25. Trình tự của trứng sán lá phổi tương đồng với loài P. skrjabini. Hình 3.26. Trình tự ITS2 của trứng sán lá tương đồng với loài Pharyngostomum cordatum. Hình 3.27. Trình tự D-Loop từ các mẫu phân dương tính sán lá phổi tương đồng cao với trình tự của mèo rừng, Prionailurus bengalensis. Hình 3.28. Sự phát triển của sán lá phổi P. westermani ở động vật thí nghiệm. Hình 3.29. Paragonimus westermani thu ở m o thí nghiệm sau gây nhiễm 120 ngày. h . Bệnh tích phổi m o nhiễm sán lá phổi P. westermani (mũi tên chỉ ổ apxe, ên trong thường chứa 2 cá thể sán, tổ chức phổi ị viêm). Hình 3.31. Khác nhau về kích thước sán non thu ở cơ (a) và gan ( ) của chuột bạch sau gây nhiễm 1 tháng. Hình 3.32. Sự phát triển của P. heterotremus ở động vật thí nghiệm. Hình 3.33. Bệnh tích đại thể phổi mèo nhiễm sán lá phổi P. heterotremus. Hình 3.34. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng (25-30oC) trong nước muối sinh lý. x Hình 3.35. Sức sống của P. westermani metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4oC ở các mật độ khác nhau. Hình 3.36. Sức sống của P. heterotremus metacercaria theo thời gian bảo quản ở 4oC ở các mật độ khác nhau. Hình 3.37. Metacercariae thoát khỏi nang ở nhiệt độ 4oC sau 2 tháng ở mật độ 200 metacercaria/2ml. Hình 3.38. Kết quả phản ứng dot-ELISA với huyết thanh. Hình 3.39. Phản ứng dot-ELISA với các nồng độ kháng nguyên và thời gian ủ khác nhau ở điều kiện 37oC. Hình 3.40. Thời gian hiện màu của phản ứng dot-ELISA ở 37oC. Hình 3.41. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở thời gian khác nhau ở 20oC. Hình 3.42. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 20oC. Hình 3.43. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 10oC. Hình 3.44. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 10oC. Hình 3.45. Phản ứng dot-ELISA ủ với huyết thanh ở các thời gian khác nhau ở 4oC. Hình 3.46. Thời gian hiện màu của phản ứng ở 4oC. 1 MỞ ĐẦU Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus, ký sinh ở phổi người và động vật, gây nên bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người và động vật. Nguyên nhân nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng cảm nhiễm metacercaria từ vật chủ trung gian thứ hai (chủ yếu là cua suối) hoặc sán non từ vật chủ chứa [1]. Người bị nhiễm sán lá phổi có biểu hiện gầy yếu, khó thở, ho từng cơn, khạc ra đờm có máu màu gỉ sắt, dễ bị chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh khác ở phổi, gây khó khăn cho công tác chẩn đoán và trị bệnh [1, 2]. Hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô tả [1], trong số đó có 7 loài gây bệnh cho người: bao gồm 2 loài gây bệnh ở châu Mỹ, 2 loài ở châu Phi và 3 loài ở châu Á [1, 2]. Tại châu Á, loài P. heterotremus gây bệnh cho người ở khu vực Nam Á (Ấn Độ và Sri Lanka), Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Việt Nam) và 3 tỉnh phía Nam Trung Quốc; loài P. westermani gây bệnh ở các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan) và Philippines; ngoài ra loài P. skrjabini gây bệnh cho người tại Nhật Bản và Trung Quốc [1]. Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong hơn 20 năm qua ở các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ [3-24]. Cho đến nay, 7 loài S