Luận án Tạo dòng hoa hồng lửa (rosa hybrida l.) mới bằng phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ NGUYỄN LAN THANH TẠO DÒNG HOA HỒNG LỬA (Rosa hybrida L.) MỚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ ĐỘT BIẾN TIA GAMMA IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ 62620110 Năm 2024 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ NGUYỄN LAN THANH P0216004 TẠO DÒNG HOA HỒNG LỬA (Rosa hybrida L.) MỚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ ĐỘT BIẾN TIA GAMMA IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ 62620110 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN GS.TS. LÊ VĂN HÒA Năm 2024 ii TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Luận án này với tựa đề “Tạo dòng hoa hồng Lửa (Rosa hybrida L.) mới bằng phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro” do nghiên cứu sinh Lê Nguyễn Lan Thanh thực hiện theo sự hướng dẫn của GS. TS. Lê Văn Hòa. Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án GS. TS. Lê Văn Hòa Lê Nguyễn Lan Thanh i LỜI CẢM TẠ Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến! GS.TS. Lê Văn Hòa, người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian để góp ý, định hướng phương pháp luận, gợi ý chỉnh sửa và động viên trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn Hội đồng đánh giá seminar toàn luận án và Hội đồng đánh giá cấp cơ sở! Đã dành nhiều thời gian đọc và đóng góp ý kiến cho luận án được hoàn chỉnh. Xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến! - Ban giám hiệu Đại học Cần Thơ, Ban giám hiệu Trường Nông nghiệp, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học cây trồng, Khoa Sau Đại học và các đơn vị phòng ban. - Quý thầy cô giảng dạy các môn học nghiên cứu sinh, quý thầy cô tham dự các hội đồng bảo vệ đề cương, các chuyên đề và tiểu luận nghiên cứu sinh. Xin trân trọng cảm ơn! - Ban Lãnh đạo Viện Cây ăn quả miền Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi nghiên cứu và học tập; các anh chị em đồng nghiệp Bộ môn Rau, Hoa và Cây cảnh, Bộ môn Chọn tạo giống đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ thực hiện một số nội dung có liên quan đến nghiên cứu này. - Ủy ban Nhân dân tỉnh Đồng Tháp, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Đồng Tháp đã duyệt đề tài “Cải thiện giống hoa hồng Lửa và hoa cúc Tiger cho làng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp” và trên cơ sở kết quả trung gian kế thừa từ đề tài đã được tôi tiếp tục nghiên cứu thực hiện để hoàn thành luận án này. - Hợp tác xã hoa kiểng Tân Quy Đông, thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp đã giúp đỡ thực hiện thí nghiệm ngoài đồng tại làng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp. - Các anh chị và các bạn học viên cùng khóa nghiên cứu sinh, Cao học và các em sinh viên đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Xin trân trọng ghi nhớ công ơn của gia đình và người thân đã luôn bên cạnh, hỗ trợ và động viên để tôi yên tâm trong học tập và công tác! Xin chân thành cảm ơn sự chia sẻ, động viên và giúp đỡ của thầy cô, các anh chị, các em và bạn bè đã luôn bên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu! Lê Nguyễn Lan Thanh ii TÓM TẮT Nghiên cứu “Tạo dòng hoa hồng Lửa (Rosa hybrida L.) mới bằng phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro” được thực hiện nhằm (1) Xác định quy trình nhân giống cho giống hoa hồng Lửa bằng phương pháp nuôi cấy mô và tạo vật liệu in vitro cho việc chiếu xạ gây đột biến bằng tia gamma; (2) Xác định liều chiếu xạ thích hợp tạo đột biến về kích thước và màu sắc hoa đối với mẫu đoạn thân hoa hồng Lửa in vitro thông qua giá trị LD50; (3) Chọn được 1 - 2 dòng hoa hồng Lửa mới có triển vọng khác biệt về hình thái (đường kính hoa to hơn, màu sắc hoa phong phú hơn) và di truyền so với giống hoa hồng Lửa gốc. Kết quả nghiên cứu đã xác định được quy trình nhân giống hoa hồng Lửa bằng phương pháp nuôi cấy mô với các bước kỹ thuật chính trong thời gian 6 tháng như sau: sử dụng môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/L để nhân nhanh (60 ngày), sử dụng túi cấy thoáng khí chứa môi trường 1/3 MS (10 ngày) nuôi trong điều kiện đèn LED 4R-1B để tạo cây hoàn chỉnh và thuần dưỡng cây trên giá thể tảo và mụn dừa (1:1) trong 20-25 ngày. Đồng thời, từ quy trình này đã nhân giống và tạo vật liệu in vitro cho việc chiếu xạ gây đột biến và áp dụng quy trình trong quá trình nhân nhanh dòng hoa hồng mới đột biến tạo ra. Đã xác định được liều gây chết LD50 là 20-25 Gy khi chiếu xạ tia gamma in vitro đoạn thân hoa hồng Lửa và liều 15 Gy tạo được nhiều đột biến đa dạng về hình dạng hoa và màu sắc hoa khác với giống hoa hồng Lửa gốc. Đã tạo được 02 dòng hoa hồng đột biến mới là dòng H1 có màu hồng cam (R52C) và dòng H2 có màu hồng (R54B) khác biệt qua phân tích di truyền ở độ tương đồng về di truyền (0.89) và có tính ổn định. Dòng hoa hồng mới H1 khác biệt về màu sắc lá và hoa so với giống hoa hồng Lửa là đột biến ổn định qua các lần nhân giống nhưng chưa thể hiện đường kính hoa to hơn. Cần tiếp tục đánh giá dòng hoa hồng mới H1 ở giai đoạn tuổi cây lớn hơn để có kết luận chính xác về đường kính hoa thể hiện đúng đặc tính của dòng. Từ khóa: đột biến, hoa hồng Lửa, in vitro, màu hoa, tia gamma. iii ABSTRACT The study "Creating a new clone of ‘Lửa’ rose (Rosa hybrida L.) using in vitro gamma ray mutation" was carried out to (1) Determine the propagation process for the ‘Lửa’ rose variety by tissue culture method and setup for in vitro mutagenic irradiation; (2) Determine the appropriate dose of irradiation to cause mutations in flower size and color for in vitro ‘Lửa’ rose stems through the LD50 value; (3) Select 1 - 2 new rose clones that have different prospects in morphology (larger flower di- ameter, new flower color) and genetics compared to the ‘Lửa’ rose variety. The research results have determined the process of propagating ‘Lửa’ roses using the tissue culture method with the following main technical steps over a period of 6 months: using MS medium supplemented with 1.0 mg/L BA to rapid multiplica- tion (60 days), using culture bags containing 1/3 MS medium (10 days) grown under LED 4R-1B light conditions to create complete plants and domesticate plants on algae and coco peat substrates (1:1) in 20-25 days. At the same time, from this process, we propagated and established in vitro stems for mutagenic irradiation and applied in this process of selecting and creating new mutant rose clones. The lethal dose LD50 has been determined to be 20-25 Gy when in vitro gamma ray irradiation of ‘Lửa’ rose stems and the dose of 15 Gy created many diverse mutations in flower shape and color that are different from the ‘Lửa’ rose variety (Original variety). There are 02 new pure mutant rose clones (H1 clone with orange-pink color R52C and H2 clone with pink color R54B) that differ through genetic analysis in genetic similarity (0.89) and sta- bility. The new H1 rose clone is different in leaf and flower color compared to the ‘Lửa’ rose variety, which is a stable mutation through propagation times but does not yet show a larger flower diameter. It is necessary to continue to evaluate the new H1 rose clone at the older plant age stage to have accurate conclusions about flower di- ameter that properly represents the characteristics of this clone. Keywords: flower color, gamma ray, in vitro, ‘Lửa’ rose, mutation iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết Luận án “Tạo dòng hoa hồng Lửa (Rosa hybrida L.) mới bằng phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro” được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS. Lê Văn Hòa. Các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Nghiên cứu của Luận án này có một phần kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài “Cải thiện giống hoa hồng Lửa và hoa cúc Tiger cho làng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp”. Đề tài có quyền sử dụng kết quả của luận án này để phục vụ cho mục tiêu báo cáo của đề tài. Các tài liệu tham khảo được xem xét và chọn lọc kỹ từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng ở phần Danh mục Tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu trong Luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác đã được công bố trước đây. Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Cần Thơ, ngày tháng năm 2024 Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án GS. TS. Lê Văn Hòa Lê Nguyễn Lan Thanh v MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang xác nhận của người hướng dẫn khoa học ............................................................... i Lời cảm tạ ........................................................................................................................ii Tóm tắt ........................................................................................................................... iii Abstract ........................................................................................................................... iv Lời cam đoan ................................................................................................................... v Mục lục ........................................................................................................................... vi Danh sách bảng ............................................................................................................... xi Danh sách hình ............................................................................................................ xiii Danh mục từ viết tắt ..................................................................................................... xvi Chương 1: Giới thiệu ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.2.1 Mục tiêu chung ....................................................................................................... 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể ....................................................................................................... 2 1.3 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 2 1.4 Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................... 3 1.5 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 3 1.6 Ý nghĩa khoa học của luận án .................................................................................... 3 1.7 Ý nghĩa thực tiễn của luận án .................................................................................... 3 1.8 Điểm mới của luận án ................................................................................................ 3 Chương 2: Tổng quan tài liệu ....................................................................................... 4 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa hồng ............................................................................. 4 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại .......................................................................................... 4 2.1.1.1 Nguồn gốc ............................................................................................................ 4 2.1.1.2 Phân loại .............................................................................................................. 6 2.1.2 Đặc điểm thực vật học ............................................................................................ 8 2.1.3 Điều kiện sinh thái của cây hoa hồng ..................................................................... 8 vi 2.1.3.1 Ánh sáng .............................................................................................................. 9 2.1.3.2 Nhiệt độ ............................................................................................................... 9 2.1.3.3 CO2 ...................................................................................................................... 9 2.1.3.4 Độ ẩm .................................................................................................................. 9 2.1.3.5 Tính chất đất đai ................................................................................................ 10 2.1.4 Sơ lược về tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa hồng trên thế giới và ở Việt Nam ........ 10 2.1.4.1 Trên thế giới ...................................................................................................... 10 2.1.4.2 Trong nước ........................................................................................................ 11 2.1.5 Một số giống hoa hồng đang trồng phổ biến ở Việt Nam .................................... 13 2.1.6 Giới thiệu về giống hoa hồng Lửa ........................................................................ 15 2.2 Phương pháp nhân giống hoa hồng bằng nuôi cấy mô............................................ 17 2.2.1 Chọn nguồn vật liệu .............................................................................................. 17 2.2.2 Khử trùng bề mặt và tiến hành nuôi cấy ............................................................... 17 2.2.3 Tạo chồi ................................................................................................................ 18 2.2.4 Ra rễ ...................................................................................................................... 18 2.2.5 Thích nghi cây và chuyển ra đất ........................................................................... 19 2.2.5 Ứng dụng một số kỹ thuật mới trong nuôi cấy in vitro ........................................ 19 2.2.5.1 Ứng dụng đèn LED trong nuôi cấy in vitro ....................................................... 19 2.2.5.2 Ứng dụng nuôi cấy thoáng khí .......................................................................... 20 2.3 Đột biến và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng ............................................ 21 2.3.1 Khái niệm đột biến ............................................................................................... 21 2.3.2 Phân loại đột biến ................................................................................................. 22 2.3.3 Các tác nhân gây đột biến ..................................................................................... 23 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây đột biến ................................................. 24 2.4 Phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro ...................................................... 24 2.4.1 Bức xạ gamma ...................................................................................................... 24 2.4.2 Một số đặc trưng của chất phóng xạ ..................................................................... 25 2.4.3 Phương pháp chiếu xạ .......................................................................................... 26 2.4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp tạo đột biến in vitro ................................... 27 2.4.5 Ứng dụng tia gamma trong tạo giống hoa ở Việt Nam ........................................ 28 vii 2.5 Cơ chế trong nghiên cứu thay đổi về màu sắc và hình dạng hoa ............................ 29 2.5.1 Cơ chế trong sự biến đổi màu sắc hoa .................................................................. 29 2.5.2 Cơ chế về sự thay đổi về hình dạng hoa ............................................................... 31 2.6 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ............................................ 32 2.6.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp..................................................................................... 33 2.6.2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter Simple Sequence Repeat –ISSR) ....................... 33 2.7 Mục tiêu và tiêu chí trong chọn tạo giống hoa hồng ............................................... 34 2.8 Một số nhận xét rút ra từ tổng quan tài liệu ............................................................ 35 Chương 3: Phương tiện và phương pháp .................................................................. 36 3.1. Phương tiện nghiên cứu .......................................................................................... 36 3.1.1 Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 36 3.1.2 Vật liệu ................................................................................................................. 37 3.1.3 Trang thiết bị và hóa chất ..................................................................................... 37 3.1.3.1 Hóa chất ............................................................................................................. 37 3.1.3.2 Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 38 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 40 3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 41 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nhân giống hoa hồng Lửa bằng phương pháp nuôi cấy mô ...... 41 3.3.1.1 Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA khác nhau đến sự nhân nhanh ................. 41 3.3.1.2 Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA bổ sung thích hợp đến sự nhân nhanh ..................................................................................................................... 42 3.3.1.3 Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của than hoạt tính trên môi trường MS/3 đến sự tạo cây hoàn chỉnh ......................................................................................................... 43 3.3.1.4 Thí nghiệm 1.4: Ảnh hưởng của 3 loại đèn chiếu sáng đến sự tạo cây hoàn chỉnh .............................................................................................................................. 44 3.3.1.5 Thí nghiệm 1.5: Ảnh hưởng của 2 loại túi cấy đến sự tạo cây hoàn chỉnh ....... 46 3.3.2. Nội dung 2: Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma đến mẫu cấy đoạn thân hoa hồng Lửa in vitro .................................................................................................... 48 3.3.2.1 Thí nghiệm 2.1: Xác định liều gây chết LD50 ................................................... 48 3.3.2.2 Thí nghiệm 2.2: Nhân nhanh và vươn chồi ....................................................... 49 3.3.2.3 Thí nghiệm 2.3: Ra ngôi và thuần dưỡng .......................................................... 50 viii 3.3.2.4 Thí nghiệm 2.4: Đánh giá quần thể và chọn lọc cá thể hoa hồng Lửa đột biến ............... 51 3.3.2.5 Thí nghiệm 2.5: Đánh giá tính ổn định về hình thái hoa của 3 cá thể hoa hồng mới chọn tạo ......................................................................................................... 53 3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá hình thái và đa dạng di truyền các dòng hồng Lửa mới chọn tạo .......................................................................................................................... 53 3.3.3.1 Thí nghiệm 3.1: Đánh giá hình thái các dòng hoa hồng Lửa mới chọn tạo từ cây chiết cành ................................................................................................................ 53 3.3.3.2 Thí nghiệm 3.2: Đánh giá hình thái dòng hoa hồng H1 mới chọn tạo từ cây cấy mô ............................................................................................................................ 57 3.3.3.3 Thí nghiệm 3.3: Đánh giá đa dạng di truyền các dòng hồng mới chọn tạo ...... 58 3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .................................................................. 61 Chương 4: Kết quả và thảo luận ................................................................................ 62 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nhân giống hoa hồng Lửa bằng phương pháp nuôi cấy mô .................................................................................................................................. 62 4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA khác nhau đến sự nhân nhanh ............................................ 62 4.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA khác nhau đến sự nhân nhanh ................ 65 4.1.3 Ảnh hưởng của than hoạt tính trên môi trường MS/3 đến sự tạo cây hoàn chỉnh ....................................................................................................................................... 67 4.1.4 Ảnh hưởng của 3 loại đèn chiếu sáng khác nhau đến sự tạo cây hoàn chỉnh ...... 69 4.1.5 Ảnh hưởng của 2 loại túi cấy khác nhau đến sự tạo cây hoàn chỉnh.................... 71 4.1.6 Tóm tắt kết quả của Nội dung 1 ........................................................................... 73 4.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma đến mẫu cấy đoạn thân hoa hồng Lửa in vitro ........................................................................................................... 74 4.2.1 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma khác nhau đến tỷ lệ sống và mức phát triển của mẫu cấy ở 30 và 60 ngày sau chiếu xạ ........................................................... 74 4.2.2 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma khác nhau đến số chồi và sự phát triển của mẫu cấy ở 90 và 110 ngày sau chiếu xạ .................................................................. 78 4.2.3 Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma khác nhau đến khả năng sống và phát triển của cây con ở giai đoạn vườn ươm ....................................................................... 81 4.2.4 Một số đặc điểm về hình thái của các quần thể chiếu xạ khác nhau .................... 82 4.2.4.1 Một số đặc điểm về hình thái cây của các quần thể chiếu xạ ............................ 82 4.2.4.2 Một số đặc điểm về thân và lá của các quần thể chiếu xạ ................................. 84 4.2.4.3 Một số đặc điểm biến dị về hoa của các quần thể chiếu xạ ............................... 86 ix 4.2.4.4 Phổ biến dị hoa hồng được tạo ra sau chiếu xạ tia gamma trên đoạn thân in vitro của giống hoa hồng Lửa ........................................................................................ 87 4.2.5 Đánh giá tính ổn định về màu sắc hoa của các cá thể chọn lọc ............................ 93 4.2.6 Tóm tắt kết quả của Nội dung 2 ........................................................................... 96 4.3. Nội dung 3: Đánh giá hình thái và đánh giá đa dạng di truyền các dòng hoa hồng mới chọn tạo ......................................................................................................... 97 4.3.1 Một số đặc điểm hình thái các dòng hoa hồng mới chọn tạo từ cành chiết ......... 97 4.3.2 Nhân giống dòng hoa hồng mới H1 bằng phương pháp nuôi cấy mô và đánh giá so sánh dòng hoa hồng mới H1 so với giống gốc từ cây cấy mô .......................... 106 4.3.2.1 Nhân giống dòng hoa hồng mới H1 bằng phương pháp nuôi cấy mô............. 106 4.3.2.2 Đánh giá so sánh dòng hoa hồng H1 so với giống hoa hồng Lửa từ cây cấy mô ................................................................................................................................ 109 4.3.3 Đánh giá đa dạng di truyền các dòng hoa hồng Lửa mới chọn tạo .................... 115 4.3.3.1. Sự đa dạng di truyền của các dòng hoa hồng mới chọn tạo ........................... 115 4.3.3.2. Mối quan hệ di truyền của các dòng hoa hồng mới chọn tạo dựa trên chỉ thị phân tử ISSR ................................................................................................................ 117 Chương 5: Kết luận và đề nghị................................................................................. 122 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 122 5.2 Đề nghị .................................................................................................................. 122 Tài liệu tham khảo Phụ lục x DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thông tin cơ bản của 3 loại đèn thí nghiệm .................................................. 44 Bảng 3.2. Các dòng hoa hồng mới chọn tạo được sử dụng để đánh giá hình thái và di truyền ......................................................................................................................... 54 Bảng 3.3: Thông tin về trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi của 31 chỉ thị ISSR ................. 58 Bảng 4.1. Số chồi, cao cụm chồi và chất lượng chồi của mẫu cấy hoa hồng Lửa in vitro ở 2 thời điểm 30 và 60 NSC .................................................................................. 62 Bảng 4.2. Số chồi, cao cụm chồi và chất lượng chồi của mẫu cấy hoa hồng Lửa in vitro ở 2 thời điểm 30 và 60 NSC .................................................................................. 65 Bảng 4.3. Một số chỉ tiêu theo dõi trên cây hoa hồng Lửa in vitro ở thời điểm 20 ngày cấy ra rễ ................................................................................................................ 67 Bảng 4.4. Một số chỉ tiêu theo dõi trên cây hoa hồng Lửa in vitro ở thời điểm 20 ngày cấy ra rễ và ở thời điểm 25 ngày sau ra ngôi ........................................................ 70 Bảng 4.5. Một số chỉ tiêu theo dõi trên cây hoa hồng Lửa in vitro ở thời điểm 15 ngày sau ra ngôi và ở thời điểm 15 ngày sau ươm ........................................................ 72 Bảng 4.6: Tỷ lệ mẫu sống (%) và mức phát triển của mẫu cấy đoạn thân hoa hồng Lửa in vitro ở thời điểm 30 và 60 NSCX ...................................................................... 74 Bảng 4.7: Đường kính cụm, chiều cao cụm và số chồi trên cụm của mẫu cấy hoa hồng Lửa in vitro ở thời điểm 90 và 110 NSCX ........................................................... 79 Bảng 4.8: Số lượng cây thu được và tỷ lệ cây sống ở các giai đoạn khảo sát của các liều chiếu xạ khác nhau ................................................................................................. 82 Bảng 4.9. Số cây quan sát, chiều cao cây và số lá trên cây của các quần thể chiếu xạ khảo sát ......................................................................................................................... 83 Bảng 4.10. Một số đặc điểm thân và lá của các quần thể chiếu xạ khảo sát ................. 85 Bảng 4.11. Một số đặc điểm về hoa của các quần thể chiếu xạ khảo sát ...................... 86 Bảng 4.12: Phổ biến dị hoa hồng được tạo ra sau chiếu xạ tia gamma trên đoạn thân in vitro của giống hoa hồng Lửa .................................................................................... 88 Bảng 4.13. Tính ổn định về màu sắc hoa của 3 cá thể chọn lọc .................................... 93 Bảng 4.14: Một số tính trạng về sinh trưởng của các dòng hồng mới chọn tạo ............ 97 Bảng 4.15: Một số tính trạng về chất lượng hoa của các dòng hoa hồng mới chọn tạo .................................................................................................................................. 98 Bảng 4.16: Một số tính trạng hình thái cây và hoa của các dòng hoa hồng mới chọn tạo ................................................................................................................................ 100 xi Bảng 4.17: Một số tính trạng về đài hoa, cánh và nhị hoa của các dòng hoa hồng mới chọn tạo ............................................................................................................... 102 Bảng 4.18: Kết quả nhân nhanh dòng hoa hồng mới H1 bằng phương pháp nuôi cấy mô ... 106 Bảng 4.19: Một số tính trạng về đặc điểm sinh trưởng của dòng hoa hồng H1 mới chọn tạo ...................................................................................................................................................... 109 Bảng 4.20: Một số tính trạng về đặc điểm hoa của dòng hoa hồng H1 mới chọn tạo 111 Bảng 4.21: Một số tính trạng về đặc điểm lá của dòng hoa hồng H1 mới chọn tạo ... 112 Bảng 4.22. Tỷ lệ phân đoạn đa hình, chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon (Ia), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) và giá trị PIC của 6 dòng hồng phân tích với 12 chỉ thị ISSR ........................................................................................................................ 116 Bảng 4.23. Tỷ lệ phân đoạn đa hình, chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon (Ia), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) và giá trị PIC của 6 dòng hồng phân tích với 12 chỉ thị ISSR ........................................................................................................................ 117 xii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ phả hệ nguồn gốc hoa hồng hiện đại theo Raymond (1999) (trích dẫn bởi Bendahmane et al., 2013) ................................................................................... 5 Hình 2.2: Sản xuất hoa hồng cắt cành tại Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (a) và sản xuất hoa hồng chậu tại Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp (b) .................................................................... 12 Hình 2.3: Một số giống hoa hồng đang trồng sản xuất tại Sa Đéc (Đồng Tháp) .......... 14 Hình 2.4: Một số cảnh quan công trình công cộng được trang trí với giống hoa hồng Lửa ................................................................................................................................. 16 Hình 2.5: Con đường sinh tổng hợp flavonoid dẫn đến sản xuất anthocyanin và một số loại flavonoid liên quan đến màu sắc của hoa (To & Wang, 2006) ......................... 30 Hình 3.1: Giống hoa hồng Lửa trồng tại làng hoa Sa Đéc (Đồng Tháp) ...................... 37 Hình 3.2: Hệ thống kệ nuôi cây có 4 tầng ..................................................................... 38 Hình 3.3: Nguồn chiếu xạ 60Co của Ấn Độ tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt ...... 38 Hình 3.4: Bảng so màu RHS (Royal Horticultural Society) của London (2007) với 4 FAN ............................................................................................................................ 39 Hình 3.5: Sơ đồ hệ thống các nội dung nghiên cứu của luận án .................................. 40 Hình 3.6: Chai cấy sử dụng cho thí nghiệm (a) và mẫu cấy in vitro của giống hoa hồng Lửa ở giai đoạn tạo mẫu khởi đầu (b) .................................................................. 42 Hình 3.7: Mẫu chồi ngọn in vitro của giống hoa hồng Lửa .......................................... 43 Hình 3.8: Máy đo cường độ ánh sáng TESTO 545 (Đức) ............................................ 45 Hình 3.9: Túi cấy PE không thoáng khí (a) và túi cấy PE thoáng khí (b) ..................... 47 Hình 3.10: Đĩa Petri chứa 25 mẫu đoạn thân in vitro của giống hoa hồng Lửa trên môi trường nuôi cấy ....................................................................................................... 48 Hình 3.11: Khu thuần dưỡng cây giai đoạn ra ngôi ...................................................... 50 Hình 3.12: Chậu trồng kích thước 12 x 10 cm (a) và ly ươm 7 x 5 cm (b) ................... 51 Hình 3.13: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích di truyền của các dòng hoa hồng mới chọn tạo .......................................................................................................................... 60 Hình 4.1: Mẫu đoạn thân in vitro của giống hoa hồng Lửa ở 2 thời điểm khảo sát ...... 63 Hình 4.2: Mẫu đoạn thân in vitro của giống hoa hồng Lửa ở thời điểm 60 NSC ......... 66 Hình 4.3: Cây hoa hồng Lửa in vitro giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh .............................. 68 Hình 4.4. Ánh sáng và chất lượng cây của 3 loại đèn ở thời điểm 20 ngày sau cấy ..... 71 xiii Hình 4.5: Cây hoa hồng Lửa cấy mô ở thời điểm 15 ngày sau ra ngôi ......................... 73 Hình 4.6: Mẫu đoạn thân in vitro của giống hoa hồng Lửa .......................................... 76 Hình 4.7: Sự phát triển của mẫu cụm chồi ở thời điểm 90 NSCX ................................ 79 Hình 4.8: Sự phát triển khác nhau của các cụm chồi ở liều chiếu xạ 15 Gy ở thời điểm 110 NSCX ............................................................................................................. 80 Hình 4.9: Hình dạng cây khi ra hoa của một số cá thể hoa hồng đột biến ở thế hệ M1V1 ............................................................................................................................. 84 Hình 4.10: Một số cá thể đột biến sinh trưởng so với cây đối chứng (ĐC) .................. 89 Hình 4.11: Một số cá thể đột biến so với cây đối chứng (ĐC) ...................................... 89 Hình 4.12: Một số dạng lá biến dị khác biệt so với đối chứng (giống gốc) .................. 90 Hình 4.13: Sự khác biệt về hình thái hoa của một số cá thể hoa hồng Lửa đột biến so với cá thể hoa đối chứng (ĐC) ở thế hệ M1V1 ......................................................... 91 Hình 4.14: Hình thái hoa của 03 thể đột biến phân lập được so với giống gốc ............ 92 Hình 4.15: Kiểu hình hoa của 3 cá thể hoa hồng........................................................... 94 Hình 4.16: Tính ổn định về kiểu hình hoa của 3 cá thể hoa hồng đột biến ở đợt hoa thứ 4 ............................................................................................................................... 94 Hình 4.17: Sơ đồ tóm tắt tính ổn định về kiểu hình hoa của 03 cá thể hoa hồng đột biến ................................................................................................................................ 95 Hình 4.18: Hình thái hoa của 6 dòng hoa hồng đánh giá ............................................ 101 Hình 4.19: Sự khác biệt về đài hoa, cánh hoa và nhị hoa của các dòng hoa hồng mới chọn tạo ........................................................................................................................ 103 Hình 4.20: Màu sắc cánh hoa theo bảng so màu FAN 1- RHS của 2 dòng hoa hồng đột biến ........................................................................................................................ 104 Hình 4.21: Sơ đồ nhân giống dòng hoa hồng H1 mới chọn tạo bằng phương pháp nuôi cấy mô ................................................................................................................. 107 Hình 4.22: Các cây hồng cấy mô (12 cây) của 2 dòng hoa hồng ............................... 108 Hình 4.23: Sự ra hoa đồng loạt của dòng hoa hồng mới H1 (a) và dòng hoa hồng Lửa HL (b) ở đợt hoa cơi thứ 2 từ cây cấy mô ............................................................ 110 Hình 4.24: Kiểu hình lá của (a) dòng hoa hồng H1 và (b) dòng hoa hồng Lửa HL từ cây cấy mô đợt hoa thứ 2 ........................................................................................ 111 Hình 4.25: Kiểu hình hoa ở đợt hoa thứ 2 của dòng hoa hồng H1 và dòng hoa hồng Lửa HL từ cây cấy mô ................................................................................................. 112 Hình 4.26. Phổ điện di sản phẩm PCR của 6 mẫu hồng .............................................. 115 xiv Hình 4.27. Sơ đồ phả hệ thể hiện mối tương quan di truyền của 6 dòng hoa hồng chọn tạo khi phân tích bằng 12 chỉ thị ISSR ............................................................... 118 xv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid BA Benzyl adenine 60Co Cobalt 60 DNA Deoxyribo nucleic acid DUS Distinctness, Uniformity and Stability ĐC Đối chứng GA3 Gibberellic acid Gy Gray IAA Indole - 3 - acetic acid IAEA International Atomic Energy Agency IBA Indole - 3 - butyric acid In vitro Trong ống nghiệm ISSR Inter Simple Sequence Repeat ITS Internal Transcribed Spacer LED Light Emitting Diode LD30 Lethal dose hoặc giá trị chết 30% LD50 Lethal dose hoặc giá trị chết 50% M1V1 Thế hệ thứ 1 ở lần nhân giống thứ 1 MS Musrashige & Skoog (1962) NAA 1- Naphthalene acetic acid NSC Ngày sau khi cấy NSCX Ngày sau khi chiếu xạ NST Ngày sau trồng PCR Plolymerase Chain Reaction RFLP Restriction frament length Reaction RHS Royal Horticultural Society xvi CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long, tỉnh Đồng Tháp là một trong những tỉnh có nghề trồng hoa kiểng lâu đời và có làng hoa truyền thống tại thành phố Sa Đéc. Làng hoa Sa Đéc hiện nay có hơn 4.000 hộ trồng hoa, cây cảnh với diện tích gần 1.000 ha và có trên 1.000 chủng loại hoa cảnh khác nhau. Lợi nhuận bình quân trên 1 hecta (ha) cây trồng năm 2022 là trên 700 triệu đồng, rất cao so với cây lúa và các loại hoa màu khác (Chi cục Thống kê thành phố Sa Đéc, 2022). Hoa kiểng Sa Đéc được phát triển mạnh và sản xuất quanh năm tập trung, nhiều nhất là các loại cây công trình và những sản phẩm đặc trưng trong mùa hoa Tết như hoa cúc, hoa hồng. Riêng nhu cầu phục vụ Tết hàng năm, Sa Đéc sản xuất trên 2 triệu giỏ hoa kiểng và nhiều nhất là hoa hồng. Ở nước ta hiện nay, nhu cầu về hoa hồng cảnh quan, hoa hồng trồng chậu đang ngày một tăng lên. Đã có nhiều vùng sản xuất hoa hồng trồng chậu với diện tích lớn, tuy nhiên nhìn chung hiệu quả trong sản xuất mang lại chưa cao. Trong đó, nguyên nhân chính xuất phát từ việc người trồng hoa chưa có được bộ giống hoa hồng phù hợp (Lê Đức Thảo, 2021). Hầu hết các giống hoa hồng được trồng hiện nay mang tính chất thương mại đều nhập được từ các nước khác và qua rất nhiều nguồn nhập khác nhau. Vì vậy, các giống hoa hồng trồng ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng, với rất nhiều màu sắc, hình dáng khác nhau và tên gọi cũng không thống nhất (Đặng Văn Đông và ctv., 2002). Bộ giống hoa hồng ở các vùng trồng luôn thay đổi, nhập mới và bổ sung làm phong phú thêm nguồn giống cho sản xuất. Tuy nhiên, chỉ những giống có ưu điểm vẫn được duy trì trong sản xuất như giống thân cao như hồng Nhung, nhiều hoa như hồng Lửa, kháng hạn tốt như hồng Tường vi (Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2010). Hoa hồng Lửa là một trong hai giống hoa hồng chủ lực của làng hoa Sa Đéc (sau hoa hồng Nhung) (Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2010). Do đặc tính ra hoa hầu như liên tục, đồng đều và đồng loạt sau mỗi đợt hoa và mỗi lần cắt tỉa cành nên giống hoa hồng Lửa dễ dàng cho việc kiến tạo nên cảnh quan đẹp. Trong khi đó, nhiều giống nhập nội như hồng leo, hồng tỷ muội rất đa dạng màu sắc và hình dáng nhưng khó tạo tán, cắt tỉa (như hồng leo) và ít sử dụng trang trí cảnh quan (như hồng tỷ muội). Do đó, việc tạo thêm dòng hoa hồng mới có màu sắc mới lạ từ việc cải thiện giống hoa hồng Lửa sẽ góp phần làm đa dạng giống hoa hồng phù hợp trang trí cảnh quan phục vụ cho sản xuất hoa hồng nơi đây. Trong công tác chọn tạo giống, trong 70 năm qua, có hơn 2.250 giống đột biến đã được phóng thích (Ahloowalia et al., 2004). Theo IAEA (2005), tia gamma là tác nhân 1 đóng góp 60,3% trong tất cả các tác nhân tạo giống đột biến. Hiện nay, có hơn 3.300 giống đột biến đã được đăng ký cho thấy việc sử dụng tác nhân gây đột biến rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng hiện đại. IAEA (2021) đã thống kê một nửa số giống cây trồng đột biến trên thế giới được tạo ra là từ việc chiếu xạ tia gamma. Phương pháp xử lý đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro đã và đang là phương pháp được áp dụng rộng rãi, mở ra triển vọng to lớn trong cải tạo giống cây trồng, đặc biệt là hoa và cây cảnh. Nhiều công trình nghiên cứu về tạo đột biến in vitro bằng việc chiếu xạ tia gamma trên cây hoa hồng đã được công bố (Smilansky et al., 1986; Datta, 2009, 2018; Arnold et al., 1998; Ibrahim, 1999; Chakrabarty & Datta, 2010; Kahrizi et al., 2013; Bala & Singh, 2013; 2015; 2016). Có nhiều giống hoa hồng mới được tạo ra trên thế giới và được phát triển sản xuất thương mại từ phương pháp này vì có sự khác biệt về màu sắc và hình dạng hoa, điển hình là 3 giống hoa hồng đột biến Rosmarun, Yulikara và Rosanda (Jain, 2006). Ở Việt Nam, đột biến tia gamma trên đối tượng hoa và cây cảnh nói chung đã có nhiều nghiên cứu công bố; nhưng riêng cây hoa hồng chỉ có vài nghiên cứu được thực hiện ở một số Viện, Trường và chỉ công bố kết quả bước đầu tạo nguồn vật liệu biến dị (Nguyễn Mai Thơm, 2009, Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2010). Từ đó cho thấy, đề tài nghiên cứu “Tạo dòng hoa hồng Lửa (Rosa hybrida L.) mới bằng phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro” đã thực hiện là rất cần thiết. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung: Cải thiện giống hoa hồng Lửa truyền thống bằng phương pháp xử lý đột biến tia gamma in vitro để tạo dòng hoa hồng Lửa mới có kích thước hoa to và màu sắc khác biệt so với giống gốc. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định quy trình nhân giống cho giống hoa hồng Lửa bằng phương pháp nuôi cấy mô và thiết lập mẫu cấy cho việc đột biến in vitro. - Xác định liều chiếu xạ thích hợp tạo đột biến về kích thước và màu sắc hoa đối với mẫu đoạn thân hoa hồng Lửa in vitro. - Chọn được 1 - 2 dòng hoa hồng Lửa mới có triển vọng khác biệt về hình thái (kích thước và màu sắc hoa) và di truyền so với giống hoa hồng Lửa truyền thống. 1.3 Đối tượng nghiên cứu Giống hoa hồng Lửa thu thập được từ làng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp được chọn làm đối tượng nghiên cứu. Mẫu đoạn thân hoa hồng Lửa in vitro được chọn làm đối tượng để xử lý đột biến nhằm tạo đột biến với lượng lớn mẫu cấy, tăng tần suất chọn ra giống hoa mới. 2