Luận án Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta (annona squamosa l.) và ứng dụng trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ TRANG TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VỎ MÃNG CẦU TA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 9.54.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TP.HCM - Năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ TRANG TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VỎ MÃNG CẦU TA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 9.54.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS PHAN TẠI HUÂN TP.HCM- Năm 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta (Annona Squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn PGS.TS Phan Tại Huân. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác cho tới thời điểm này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 02 năm 2023 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Trang ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta (Annona Squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm”. Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ và tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ, giảng viên, chuyên viên Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM; tập thể Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm -Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM; tập thể Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, cán bộ các phòng, ban chức năng Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy Phan Tại Huân đã trực tiếp hướng dẫn, góp ý, hỗ trợ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Quý đồng nghiệp, sinh viên đại học ngành Công nghệ Thực phẩm, ngành đảm bảo chất lượng các khóa Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Cuối cùng, Tôi xin gửi lời biết ơn đến gia đình đã luôn đồng hành, động viên, khích lệ, ủng hộ về tài chính và thời gian trong suốt chặng đường khó khăn để hoàn thành luận án nghiên cứu này. Đặc biệt, Tôi xin tặng ba mẹ các thành quả mà con đã đạt được. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Trang iii TÓM TẮT Tên luận án: “Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ mãng cầu ta (Annona Squamosa L.) và ứng dụng trong thực phẩm”. Tác giả: Nguyễn Thị Trang Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm. Mã số: 9.54.01.01 Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định phương pháp trích ly tối ưu để thu nhận dịch chiết có hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa cao từ vỏ mãng cầu ta (Annona Squamosa L.). Đồng thời, định danh các hợp chất có hoạt tính sinh học sinh học, đánh giá khả năng kháng khuẩn, tính an toàn của dịch chiết và ứng dụng dịch chiết trong bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh. Bên cạnh đó, xác định nồng độ chất mang phù hợp để sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta, xác định các chỉ tiêu hóa lý, đánh giá khả năng kháng khuẩn và xây dựng mô hình dự đoán shelf – life của dịch chiết và bột sấy phun. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vỏ mãng cầu sấy ở nhiệt độ khoảng 600C trong 8 giờ sẽ thu được bột vỏ mãng cầu có hàm ẩm khoảng 12%, có hàm lượng polyphenol và hoạt tính sinh học cao hơn so với các chế độ sấy khác. Trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ vi sóng với nồng độ ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25 (g/mL), thời gian 5 phút, công suất 214 W thu được dịch chiết có hàm lượng TPC 100,15 mg GAE/g CK, hoạt tính kháng oxy hóa 673,0 mol TE/g CK (DPPH) và 1409,6 mol TE/g CK (ABTS) cao nhất so với các phương pháp khác. Dịch chiết, bột sấy phun vỏ mãng cầu ta có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như tanin, saponin, steroid, terpenoid, coumarin v.v. có khả năng kháng lại vi khuẩn Staphylococus aureus (ATCC 29213), Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella spp. và Lysteria spp. Tôm thẻ chân trắng được nhúng vào dung dịch chitosan 1,5% có bổ sung dịch chiết mãng cầu với hàm lượng polyphenol 300 mg GAE/l, bảo quản ở 40C sau 12 ngày sản phẩm có độ giảm khối lượng tôm nhỏ nhất, chỉ số PV là 4,93 meq/kg, iv chỉ số TBARs là 1,73 mg MDA/kg, tổng hàm lượng nitơ bay hơi TVB-N đạt 28,39 mg N/100g, mẫu giữ được màu sắc và cấu trúc tốt hơn so với các mẫu còn lại. Nghiên cứu cho thấy, sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu với gum arabic 10%, bột sấy phun có hàm lượng polyphenol cao hơn so với các nồng độ khác, có độ ẩm 4,73%, độ hòa tan từ 87,25%, độ hút ẩm 34,57 g/100g, tỷ trọng 371,81 g/L. Nghiên cứu đã sử dụng hệ số Q10 để khảo sát sự suy giảm TPC và TEAC của dịch chiết, bột sấy phun vỏ mãng cầu ta với chất mang gum arabic 10%. Ở nhiệt độ 300C, thời hạn bảo quản dịch chiết có TPC và TEAC còn lại 85% so với ban đầu lần lượt là 30,79 ngày; 15,54 ngày theo DPPH và 14,4 ngày theo ABTS; thời gian bảo quản GA 10% có TPC, TEAC còn 85% lần lượt là 13,17 ngày; 18,27 ngày (DPPH) và 24,73 ngày (ABTS) ngày. Sự suy giảm TPC và TEAC theo DPPH và ABTS đều phù hợp với mô hình bậc 2 với hệ số tương quan (R2) lớn hơn 0,95. Nghiên cứu cũng đã xác định dịch chiết vỏ mãng cầu ta không tạo ra tác dụng phụ đối với hành vi và bệnh lý tổng quát của chuột ở nghiên cứu độc tính mãn và độc tính cấp (LD50 7000 mg/kg) và có khả năng phòng viêm khớp dạng thấp. HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Phan Tại Huân NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Thị Trang v ABSTRACT Extraction of bioactive compounds from custard apple (Annona Squamosa L.) peel and its application in food Ph.D. candidate: Nguyen Thi Trang Major: Food Technology Major code: 9.54.01.01 The study aimed to optimize the extraction of the custard apple, Annona Squamosa L. (AS), peel to obtain extracts with high polyphenol content and antioxidant activity. With that, phytochemical screening of the extract was performed. Antibacterial activities and the acute and chronic toxicity of the extract were also determined. Custard apple peel extract was tested as a natural additive for the preservation of Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei) during cold storage. Besides, the spray-dried encapsulation of AS peel extract was conducted at different concentrations of carrier agents. The physical properties, antioxidant, and antibacterial properties of the spray-dried product were evaluated. Then, modeling was used to predict the shelf-life of the extracts and encapsulated powders. The study results showed that the extraction pretreatment of AS peels with hot-air drying at 60°C for 8 hours led to a moisture content of ≤ 12% and the best total polyphenol content (TPC) and biological activities. Microwave-assisted extraction (MAE) can be successfully used to extract polyphenols from the AS peel. The optimum condition was found at an ethanol concentration of 60%, extraction time of 5 min, a solvent-solid ratio of 25 mL/g, and microwave power of 214 W. Under these conditions, the extract of custard apple peel achieved a TPC of 100.15 mg GAE/g d.w, an antioxidant activity of 673.0 µmol TE/g in the DPPH assay, and 1409.6 µmol TE/g in the ABTS assay. The bioactive compounds in the AS peel extracts and powder products showed the presence of tannins, saponins, steroids, terpenoids, and coumarins. Antimicrobial activity of the AS peel extract was proven against six bacterial strains possibly causing food poisoning diseases, including Staphylococcus aureus (ATCC 29213), vi Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella spp. and Listeria spp. Shrimps treated with a 1,5% chitosan-AS extract coating solution had lower increases in weight loss, pH, PV (4.93 meq/kg), TBARs (1.73 mg MDA/kg), TVB-N (28.39 mg N/100g), and improved color and texture properties, compared with the control samples during 12 days of cold storage (4°C). The best quality was obtained from shrimps coated with chitosan-incorporated AS extract at a concentration of 300 mg GAE/L. A concentration of 10% gum arabic (GA) was considered proper to obtain the AS peel extract encapsulation with the highest TPC. The spray-dried powder was obtained at a very low moisture content of 4.73%, water solubility index of 87.25 %, hygroscopicity of 34.57 g/100 g, and bulk density of 371.81 g/L. The shelf life of the product was assessed by using the Q10 value. It showed that the TPC and TEAC degradation rates of the AS peel extract are greater than those obtained with the spray-dried powder. The TPC and TEAC retentions of 85% of the AS peel extracts were 30.79 days, 15.54 days (according to DPPH assay), and 14.4 days (according to ABTS assay), respectively. While those obtained with the 10% GA spray-dried powder were 13.17 days, 18.27 days (DPPH assay), and 24.73 days (ABTS assay), respectively. The degradations of TPC and TEAC according to the DPPH and ABTS assays were correlated well with the developed second-order models by a correlation coefficient (R2) greater than 0.95. The study also showed that AS peel extract demonstrated no adverse effects on the general behavior and pathology determinations of mice in chronic and acute toxicity testing (LD50 7000 mg/kg), and proved potential prevention and treatment of rheumatoid arthritis. vii MỤC LỤC CHƯƠNG 1 ................................................................................................................ 1 TỔNG QUAN ............................................................................................................. 1 1.1. Tổng quan về polyphenol ..................................................................................... 1 1.1.1. Phân loại polyphenol ......................................................................................... 1 1.1.2. Hoạt tính sinh học của polyphenol .................................................................... 3 1.2. Tổng quan về mãng cầu ta ................................................................................... 5 1.2.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 5 1.2.2. Đặc điểm ........................................................................................................... 5 1.2.3. Hoạt tính sinh học mãng cầu ............................................................................. 6 1.2.4. Một số nghiên cứu về mãng cầu ta trong và ngoài nước .................................. 6 1.3. Tổng quan về trích ly ........................................................................................... 8 1.3.1. Nguyên lý quá trình trích lytrích ly ................................................................... 8 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly ..................................................... 8 1.3.3. Các phương pháp trích ly .................................................................................. 9 1.4. Kỹ thuật sấy phun tạo sản phẩm bột hòa tan ...................................................... 13 1.5. Nghiên cứu về độc tính và kháng viêm của nguyên liệu thực vật ..................... 14 1.6. Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản thủy hải sản.............................................. 15 CHƯƠNG 2 .............................................................................................................. 18 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 18 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 18 2.1.1 Nguyên liệu ...................................................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ......................................................................................... 19 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................... 20 viii 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa ........................................................................................................... 22 2.2.2. Trích ly vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ enzyme (pectinase, cellulase, hỗn hợp pectinase/ cellulase) với dung môi nước ................................................................... 22 2.2.3. Trích ly vỏ mãng cầu ta bằng phương pháp khuấy từ ..................................... 23 2.2.4. Trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có hỗ trợ vi sóng ........................ 24 2.2.5. Sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu, xác định tính chất hóa lý bột sấy phun..... 26 2.2.6. Xây dựng mô hình dự đoán thời hạn (shelf-life) bảo quản dịch chiết, bột sấy phun ........................................................................................................................... 26 2.2.7. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết và bột sấy phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta ............................................................. 27 2.2.8. Đánh giá tính an toàn dịch chiết vỏ mãng cầu ................................................ 29 2.2.9. Ứng dụng dịch chiết mãng cầu trong điều trị viêm khớp dạng thấp ở chuột .. 30 2.2.10. Ứng dụng dịch chiết bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh ............. 31 2.3. Các phương pháp phân tích ................................................................................ 32 2.3.1. Xác định phenolic tổng theo phương pháp Folin- Ciocalteu .......................... 32 2.3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol theo phương pháp DPPH 33 2.3.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol theo phương pháp ABTS 33 2.3.4. Định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học............................................. 33 2.3.5. Xác định thời hạn bảo quản (Shelf - life) cao chiết, bột sấy phun vỏ mãng cầu ................................................................................................................................... 34 2.3.6 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý tôm thẻ chân trắng ......................................... 35 2.3.7. Xác định một số tính chất hóa lý của bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta ........... 37 2.3.8. Các thông số đánh giá tính an toàn của dịch chiết vỏ mãng cầu ta ................. 38 ix 2.3.9. Phân tích huyết học và sinh hóa máu .............................................................. 39 2.3.10. Xác định khối lượng cơ quan tương đối ....................................................... 39 2.3.11. Phân tích nước tiểu ........................................................................................ 40 2.3.12. Đánh giá mô học ........................................................................................... 40 2.3.13. Đánh giá các thông số thực nghiệm mô hình trị viêm khớp dạng thấp ở chuột bằng dịch chiết vỏ mãng cầu ta ................................................................................. 40 2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 41 CHƯƠNG 3 .............................................................................................................. 42 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 42 3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến TPC và TEAC của vỏ mãng cầu ta ...................... 42 3.2. Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ vỏ mãng cầu với sự hỗ trợ của enzyme với dung môi nước .................................................................................................... 44 3.2.1. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme pectinase/cellulase .................................................. 44 3.2.2. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi .......................................................... 45 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly ............................................................. 47 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng pH ................................................................................... 49 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme ............................................................. 52 3.3. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ khuấy từ với dung môi ethanol ................ 55 3.3.1. Ảnh hưởng thời gian trích ly ........................................................................... 55 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol .............................................................. 56 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM ................................................................... 56 3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ........................................................................... 57 3.4. Khảo sát quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng ...................................................... 58 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol .............................................................. 58 x 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ........................................... 59 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly ............................................................. 60 3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng công suất trích ly ............................................................ 61 3.4.5. Tối ưu hóa trích ly TPC, TEAC từ vỏ mãng cầu ta có hỗ trợ vi sóng ............ 62 3.5. Tính chất hóa lý bột sấy phun vỏ mãng cầu ta với chất mang khác nhau.......... 68 3.5.1 Độ ẩm, TPC, TEAC của bột sấy phun với gum arabic và maltodextrin .......... 68 3.5.2 Độ màu, hiệu suất thu hồi bột sấy phun từ vỏ mãng cầu ta ............................. 70 3.5.3. Tỷ trọng, độ hút ẩm, độ hòa tan và góc nghỉ của bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta................................................................................................................ 71 3.5.4. Đặc điểm hình dạng và kích thước phân bố hạt của bột sấy phun .................. 73 3.6. Xây dựng mô hình dự đoán thời gian bảo quản (shelf-life) dịch chiết và bột sấy phun dịch chiết vỏ quả mãng cầu ta .......................................................................... 76 3.6.1. Xây dựng mô hình dự đoán thời gian bảo quản dịch chiết vỏ mãng cầu ta .... 76 3.6.2. Xây dựng mô hình shelf – life (mô hình dự đoán thời gian bảo quản) cho bột sấy phun GA 10% ..................................................................................................... 80 3.7. Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học, đánh giá khả năng kháng khuẩn cao chiết và bột sấy phun dịch chiết vỏ mãng cầu ta ....................................................... 83 3.7.1. Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học .................................................. 83 3.7.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết và bột sấy phun vỏ mãng cầu ta ..................................................................................... 85 3.8. Ứng dụng dịch chiết trong bảo quản tôm thẻ chân trắng ở điều kiện lạnh ........ 91 3.8.1. Ảnh hưởng nồng độ polyphenol dịch chiết đến khối lượng tôm .................... 91 3.8.2. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến giá trị pH ....................... 92 3.8.3. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số PV ....................... 93 xi 3.8.4. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số TVB–N ............... 95 3.7.5. Ảnh hưởng của nồng độ polyphenol dịch chiết đến chỉ số TBARs ................ 96 3.7.6. Ảnh hưởng của nồng