Luận án Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ TRÚC LINH TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (Vibrio parahaemolyticus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CẦN THƠ, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ TRÚC LINH TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (Vibrio parahaemolyticus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRƯƠNG QUỐC PHÚ CẦN THƠ, 2018 i ii LỜI CẢM TẠ Trước hết tôi xin trân trọng và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn PGs.Ts. Trương Quốc Phú và PGs.Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh trong những năm qua đã ân cần hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu để chăm bồi kiến thức và hoàn thành Luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Đề án Trà Vinh 100 tỉnh Trà Vinh, Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Nông nghiệp Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện chương trình Nghiên cứu sinh. Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGs.Ts. Vủ Ngọc Út đã có những ý kiến góp ý rất quý báo để giúp tôi hoàn thành chuyên đề nghiên cứu sinh. Hơn thế nữa, tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến dự án Vlir đã điều kiện cho tôi có được nguồn kinh phí để thực hiện đề tài. Đồng thời, xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Phạm Thị Tuyết Ngân đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề, góp ý đề cương luận án để tôi có thể hoàn thành đúng tiến độ. Trân trọng gởi lời cảm ơn đến PGS. Ts Từ Thanh Dung và PGS.Ts. Trần Thị Tuyết Hoa đã tận tình giúp tôi trong việc góp ý đề cương Luận án, chuyên đề và tiểu luận tổng quan. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ đã rất nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu. Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em. Ks. Phan Công Minh (Giám đốc Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Một thành viên APC); Ths. Trần Trung Giang, Ts. Huỳnh Kim Hường, NCS. Nguyễn Thanh Tâm, Ks. Nguyễn Trọng Nghĩa, NCS. Trần Việt Tiên, NCS. Nguyễn Hùng Sơn, Ks. Lê Ngọc Huyền, Ks. Nguyễn Thị Ngọc Huyền, Ks. Huỳnh Thanh Phong, Ks. Ngô Chí Nguyện, Ks. Huỳnh Trung Kiên, Ks. Trần Việt Khánh, NCS. Hồng Mộng Huyền, Ks. Nguyễn Ngọc Anh cùng các anh chị em đồng nghiệp tại Trường Đại học Trà Vinh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành Luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên để tôi có thêm nghị lực hoàn thành Luận án này. Nguyễn Thị Trúc Linh iii TÓM TẮT Tuyển chọn vi khuẩn lactic (LAB) kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được thực hiện tại Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 12/2014 đến 4/2017. Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra chủng LAB có khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng. Nghiên cứu được thực hiện với các nội dung (1) Phân lập LAB từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng và sàng lọc các chủng LAB bằng các chỉ tiêu: hình thái, sinh lý, sinh hóa; (2) Xác định tính đối kháng của LAB phân lập được với vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, đồng thời xác định khả năng kháng V. parahaemolyticus bằng bacteriocin và khả năng chịu đựng nồng độ muối của 5 chủng LAB kháng với V. parahaemolyticus mạnh nhất cũng được tiến hành; (3) Thử nghiệm ảnh hưởng của LAB bổ sung vào thức ăn lên khả năng kháng AHPND. Thí nghiệm này đã được tiến hành nhằm xác định ảnh hưởng của LAB bổ sung vào thức ăn đến tỷ lệ sống và khả năng kháng AHPND trên tôm thẻ chân trắng. Đồng thời, ảnh hưởng của việc bổ sung C, N và P lên khả năng kháng AHPND của 3 chủng LAB cũng được xác định; (4) Định danh chủng LAB có khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ. Kết quả phân lập LAB từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm biển ở 3 tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng và Bến Tre đã thu được 94 chủng LAB bao gồm: 30 chủng LAB ở Trà Vinh, 25 chủng LAB ở Sóc Trăng, và 39 chủng LAB ở Bến Tre. Kết quả sàng lọc về các chỉ tiêu hình thái cho thấy tất cả các khuẩn lạc phân lập được đều có màu trắng đục, tròn, lồi, có kích cỡ 1-2 mm sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS agar bổ sung 1,5% NaCl. Đối với chỉ tiêu sinh lý cũng cho thấy rằng dưới kính hiển vi LAB có hình cầu và hình que, Gram dương, không sinh bào tử. Kết quả xác định đặc điểm sinh hóa đã chỉ ra rằng tất cả các chủng LAB được lựa chọn đều có khả năng làm tan CaCO3, âm tính oxidase và catalase nhưng dương tính với O/F. Kết quả xác định tính đối kháng bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch đã cho thấy hầu hết 94 chủng LAB phân lập được đều có khả năng kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Trong 94 chủng phân lập được có 82 chủng LAB có khả năng kháng với V. parahaemolyticus nhưng chỉ ở mức yếu (+) và trung bình (++). Mười hai chủng LAB còn lại bao gồm 08 chủng phân lập được ở Trà Vinh và 04 chủng LAB phân lập ở Bến Tre có khả năng kháng V. parahaemolyticus ở mức cao (+++) với vòng kháng khuẩn lớn hơn 16 mm, đặc biệt có 05 chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) có khả năng kháng V. parahaemolyticus mạnh nhất với vòng kháng khuẩn từ 17,5-18,5 iv mm. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo bacteriocin và tính kháng khuẩn của LAB với V. parahaemolyticus cho thấy rằng chúng không có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus thí nghiệm. Các chủng LAB dùng trong thí nghiệm đều phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 5‰ với thời gian nuôi 48 giờ và phát triển chậm hơn ở độ mặn 25‰ với thời gian nuôi 96 giờ. Kết quả xác định thời gian và mật số LAB khác nhau lên khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus cho thấy mật số LAB đến 107 CFU/mL với các thời gian nuôi từ 24 đến 96 giờ đều không có khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus. Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của việc bổ sung LAB vào thức ăn đến tỷ lệ sống và khả năng kháng AHPND trên tôm thẻ chân trắng đã cho thấy ở các nghiệm thức có bổ sung LAB vào thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus thì tỷ lệ sống của tôm rất cao và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm (87,77%). Tỉ lệ sống của tôm cao nhất là ở nghiệm thức bổ sung chủng LAB5 (92,23%). Ngoài ra, tôm ở các nghiệm thức này không có dấu hiệu AHPND. Ở các nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus, tôm có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của AHPND và chết nhiều nhất ở nghiệm thức VP+LAB3, tỉ lệ chết lên đến 70,02%, kế đến là nghiệm thức đối chứng dương (54,43%) và nghiệm thức VP+LAB4 (43,33%). Tuy nhiên, ở các nghiệm thức VP+LAB1,VP+LAB2 và VP+LAB5 tôm có tỷ lệ sống khá cao từ (73,33-79,77%), khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ĐCA (87,77%) và phần lớn mẫu gan tụy thu được không có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của bệnh hoại tử gan tụy cấp tính khi phân tích mô bệnh học. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng AHPND của LAB có bổ sung các thành phần acid glutamic, đường trehalose, KH2PO4, và K2HPO4 với tỷ lệ C, N, P là 15, 1, 0,1 cho thấy hầu hết các nghiệm thức khi bổ sung các thành phần trên, tỷ lệ sống của tôm thấp hơn so với các nghiệm thức không bổ sung trong trường hợp có và không có cảm nhiễm V. parahaemolyticus. Đối với các nghiệm thức không cảm nhiễm V. parahaemolyticus thì tôm không có biểu hiện bệnh lý đặc trưng của AHPND, tỷ lệ sống của tôm lên đến 88,2% đối với nghiệm thức không bổ sung C, N, P và 82% đối với nghiệm thức có bổ sung C, N, P. Tuy nhiên, hai nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau. Kết quả phân tích mô bệnh học cũng không thấy mẫu gan tụy có dấu hiện bất thường. Tuy nhiên, các nghiệm thức có cảm nhiễm V. parahaemolyticus và bổ sung C, N, P thì tỷ lệ sống của tôm thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại. Tỷ lệ sống thấp nhất là ở nghiệm thức đối chứng dương có bổ sung và không bổ sung C, N, P lần lượt là (47 và 52%) và tỉ lệ v sống cao nhất là nghiệm thức LAB1 (76 và 78%). Kết quả mô bệnh học cho thấy ở các nghiệm thức bổ sung C, N, P và LAB đồng thời cảm nhiễm V. parahaemolyticus thì gan tụy tôm ít bị ảnh hưởng của sự cảm nhiễm AHPND. Việc bổ sung LAB vào thức ăn đặc biệt là chủng LAB1 có khả năng làm hạn chế AHPND trên tôm thẻ. Kết quả định danh chủng LAB1 bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA đã xác định chủng vi khuẩn này là Lactobacillus plantarum. Từ khóa: AHPND, LAB, Lactobacillus plantarum, Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), Vibrio parahaemolyticus. vi ABSTRACT Isolation and selection of lactic acid bacteria (LAB) that can antagonize V. parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in white-leg shrimp (Penaeus vannamei) were conducted from December 2014 to April 2017 at Can Tho University. The objectives of this research were selecting LAB strains that can antagonize V. parahaemolyticus and using these strains to prevent from AHPND in culture shrimp. The study was carried out with following four major contents: (1) Isolating LAB strains from gut of white-leg shrimp (Penaeus vannamei), gut of nile tilapia (Oreochromis niloticus) and shrimp pond sediment in Tra Vinh, Ben Tre, and Soc Trang provinces. Isolated LAB strains were identified by using morphological, physiological and bio-chemical characteristics. (2) Determining their antagonism against V. parahaemolyticus of LAB strains by using agar well diffusion method. Experiment can also determine their resistance to V. parahaemolyticus by bacteriocin and the ability of salt tolerance of 5 LAB strains that resist to the virulence V. parahaemolyticus also conducted. (3) The effects of dietary LAB additive on resistance to AHPND. This experiment was conducted to determine the effects of dietary LAB additive on survival and the resistance to AHPND. At the same time, the effects of C, N, and P supplementation on the resistance to AHPND of the three strains of LAB was also determined. (4) Identification of LAB strain that is resistant to AHPND in white-leg shrimp. The result of isolation LAB strains from gut of white-leg shrimp, gut of nile tilapia and shrimp pond sediment in Tra Vinh, Ben Tre, and Soc Trang provinces were found out 94 LAB strains including: 30 strains from TraVinh, 25 strains from Soc Trang and 39 strains from Ben Tre. Screening results for morphological characters showed that all the isolated colonies were milky, round, convex, 1-2 mm in size and capable of dissolving CaCO3 after 48 hours of culture on MRS agar supplemented with 1,5% NaCl. Physiological properties also indicate that the LAB has a spherical (56 stains) and rod (38 strains) shaped, Gram-positive, non-spore-forming. Biochemical characteristics have shown that all strains of LAB indicate negative reaction for oxidase and catalase but positive for O/F. The results of antagonistic determination by agar-well diffusion method showed that almost of 94 isolated LAB strains were resistant to V. parahemolyticus. Of these, 82 strains of LAB were weak (+) and medium (++) resistant to V. parahaemolyticus. Only 12 strains of LAB, 8 strains were isolated in Tra Vinh and 4 were isolated in Ben Tre were strongly resistant vii (+++) to V. parahaemolyticus with zone of inhibition greater than 16mm. Five strains of LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) showed the strongest resistance to V. parahaemolyticus with antibacterial rings from 17,5 to 18,5mm. The results of resistance trials to V. parahaemolyticus of the 5 strains of LAB by bacteriocin indicated that they were not able to inhibit V. parahaemolyticus bacteria. All LAB strains used in the experiment were able to grow at a salinity of 0-25ppt, but grew well in 5ppt of salinity in 48 hours of culture. They grew much slower in 25ppt of salinity in 96 hours of culture. The results of the effects of different time culture and density of LAB on V. parahaemolyticus resistance ability showed that at the density of LAB from 107 CFU/mL or less and culture time from 24 to 96 hours, LAB were not resistant to V. parahaemolyticus. The results of the effect of dietary LAB additive on survival rate and resistance to AHPND in Penaeus vannamei showed that the survival rate of shrimp was very high from 82,23 to 92,23% in the treatments of dietary LAB additive without challenged with V. parahaemolyticus, and there were not significantly different to the negative control treatment (87,77%). The highest survival rate was obtained in the treatment of dietary LAB5 additive (92,23%). In addition, shrimps did not show any symptoms of AHPND. In the challenged treatments with V. parahaemolyticus, shrimps showed the typical clinical signs of AHPND. The mortality rate was highest in VP+LAB3 treatment (70,02%), followed by the positive control treatment (54,43%) and VP+LAB4 treatment (43,33%). In the VP+LAB1, VP+LAB2 and VP+LAB5 treatments, shrimps also had the high survival rate (73,37% to 79,97%) and shrimp’s hepatopancreas were less affected by AHPND. In summary, the survival rate and the resistance to AHPND were significantly improved in white-leg shrimp feeding with diets containing LAB1, LAB2, or LAB5 strains. The results of the effects of dietary LAB additive and acid glutamic, Trehlose, KH2PO4, K2HPO4 supplementation into water with C, N, P ratio 15, 1, 0,1 on survival rate and resistance to AHPND in Litopenaeus vannamei showed that almost of treatments with C, N, P supplementation indicated the survival rate of shrimp were lower than those without C, N, P supplementation in case with or without V. parahaemolyticus challenged. In non-challenged V. parahaemolyticus treatments, there were no signs of AHPND on shrimps. The survival rate of shrimp was 88,2% for C, N, P non-supplementaiton treatment and 82% for C, N, P supplementation treatment. Results from histological analyses did not show any abnormalities of hepatopancreas. However, viii treatments with C, N, P supplementation and V. parahaemolyticus challenged showed the survival rate of shrimp was lower than did of the other treatments. The lowest survival rate was found in positive treatments with or without C, N, P supplementation (47% and 52%, respectively) and the highest survival rate was LAB1 treatments (76% and 78%). Results from histological analyses showed that in the treatments with C, N, P supplement, dietary LAB additive with V. parahaemolyticus challenged, shrimp’s hepatopancreas were less affected by AHPND. Dietary LAB additive (especially LAB1 strain) was able to reduce the effect of AHPND on white-leg shrimp. The result of identification with RNA sequencing (16s-rRNA) have shown that LAB1 strain was Lactobacillus plantarum. Keywords: AHPND, LAB, Lactobacillus plantarum, Penaeus vannamei, Vibrio parahaemolyticus. ix MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM TẠ ................................................................................................... ii TÓM TẮT ........................................................................................................ iii ABSTRACT ..................................................................................................... vi DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... xiii DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xvi Chương 1: GIỚI THIỆU ................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu tổng quát....................................................................................... 2 1.3. Mục tiêu cụ thể ............................................................................................ 2 1.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2 1.5. Ý nghĩa nghiên cứu ..................................................................................... 3 1.6. Điểm mới của luận án ................................................................................. 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4 2.1. Sơ lược về tôm thẻ chân trắng .................................................................... 4 2.1.1. Hiện trạng nghề nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới ........................ 5 2.1.2. Hiện trạng nghề nuôi tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam ........................ 7 2.2. Sơ lược về tình hình dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong và ngoài nước ................................................................................................................... 9 2.2.1. Tình hình bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên thế giới ......................... 9 2.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh hoại tử gan tụy cấp ở Việt Nam ............ 10 2.3. Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và các nghiên cứu về độc lực của V. parahaemolyticus ......................................................... 12 2.3.1. Các thông tin liên quan đến đặc điểm của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh trên tôm ............................................................... 12 2.3.2. Thông tin gen độc lực của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh trên tôm ................................................................................................... 13 2.3.3. Đặc điểm bệnh học ............................................................................ 14 2.3.4. Đặc điểm dịch tễ học ......................................................................... 16 2.3.5. Các nghiên cứu về độc lực của V. parahaemolyticus ........................ 17 x 2.3.6. Các yếu tố môi trường tác động đến vi khuẩn V. parahaemolyticus 18 2.3.7. Một số giải pháp được áp dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy ... 19 2.4. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic ..................................................... 21 2.4.1. Sơ lược về vi khuẩn lactic ................................................................. 21 2.4.2. Đặc tính chung của vi khuẩn lactic ................................................... 23 2.4.3. Ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên sự phát triển của LAB .......... 24 2.4.4. Khả năng kháng với kháng sinh ........................................................ 25 2.4.5. Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ........................................... 25 2.4.6. Các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic trong nuôi trồng thủy sản ...................................................................................... 28 Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 38 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................