Luận án Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng lilium có khả năng chịu nóng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ THU HƯƠNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bùi Thị Thu Hương ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Trịnh Khắc Quang Viện Nghiên cứu Rau quả Hà Nội, 2015 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015 Tác giả Bùi Thị Thu Hương ii Lời cám ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS.TS. Trịnh Khắc Quang đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học cùng lãnh đạo, cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam và bộ môn Công nghệ sinh học, viện Nghiên cứu Rau Quả đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo và cán bộ thuộc bộ môn Thực vật, khoa Nông học, bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hương iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT Ký hiệu Chữ viết tắt 1 A. rhizogenes Agrobacterium rhizogenes 2 A. rubi Agrobacterium rubi 3 A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 4 ADN Acid Deoxirionucleic 5 AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) 6 BA 6-benzyl adenine 7 Bp Base pair 8 CaMV Cailiflower Mosaic Virus 9 Car Carbenicillin 10 Cefo Cefotaxime 11 Chloram Chloramphenicol 12 CodA Choline oxidase 13 CS Cộng sự 14 CT Công thức 15 ĐC Đối chứng 16 E. coli Escherichia coli 17 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid 18 Et al Đồng tác giả 19 EtBr Ethidium Bromid 20 GB Glycine betaine 21 Genta Gentamycine 22 GFP Green Fluorescent Protein 23 GUS β-1,4-Glucuronidase 24 Hpt Hygromycine Phosphotransferase 25 HSF Heat shock factor 26 HSPs Heat shock proteins 27 Hygr Hygromycine resistant iv STT Ký hiệu Chữ viết tắt 28 ISSR Inter Simple Sequence Repeat 29 Kana Kanamycine 30 LB Luria Bertani 31 M Thang Marker chuẩn 32 MAS Marker assisted selection 33 MDA Malondialdehyde 34 Mm Millimolar 35 MS Murashige and Skoog, 1962 36 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein 37 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β-D-glucoronide 38 µl micro litte 39 µM Micromolar 40 NptII Neomycin Phosphotransferase II 41 PCR Polymerase Chain Reaction 42 Pic Picloram 43 QTL Quantitative trait loci 44 RAPD Random Amplified Polymorphic AND 45 Rifa Rifamycine POD Peroxidase 46 SOD Superoxide dismutase 47 T-ADN Transfer-ADN 48 TAE Tris-acetate-EDTA 49 Ti-plasmid Tumor inducing Plasmid 50 TP Transit Peptide 51 Vir Virulence 52 WT Dòng không chuyển gen 53 X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoronide 54 α-NAA 1- Naphthaleneacetic acid v MỤC LỤC Trang Lời cam đoan .............................................................................................................. i Lời cám ơn ................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ........................................... iii MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... x MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Tổng quan về cây lily ..................................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chung về lily .................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily ................................... 3 1.1.3. Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily ..................... 4 1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của cây lily .............................................................................................................. 5 1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật ................................................... 6 1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật ........................................................ 6 1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily ......................................................... 8 1.2.3. Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily .................................. 9 1.3. Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở thực vật .......................................................................................................... 15 1.3.1. Giới thiệu chung về glycine betaine .............................................................. 15 1.3.2. Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng ............... 16 1.4. Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công nghệ gen......................................................................................................... 17 1.4.1. Công nghệ tế bào trong tạo giống lily ............................................................ 17 1.4.2. Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily ................................ 18 vi CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21 2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 21 2.1.1. Thực vật ........................................................................................................... 21 2.1.2. Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ............................................ 22 2.1.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 24 2.1.4. Máy móc và thiết bị ......................................................................................... 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25 2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu ...................... 25 2.2.2. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi .......................................................................................................... 27 2.2.3. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng kỹ thuật gen ......................................................................................................... 30 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 37 3.1. Đánh giá tập đoàn các giống lily nghiên cứu ............................................. 37 3.1.1. Đánh giá quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử ............................................................................................................ 37 3.1.2. Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của một số giống lily nghiên cứu ...... 39 3.1.3. Ngưỡng chịu nóng in vitro của một số giống lily nghiên cứu ....................... 41 3.2. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi ................ 44 3.2.1. Kiểm tra chất lượng hạt phấn của một số giống hoa lily nghiên cứu ............ 44 3.2.2. Lai tạo và cứu phôi ......................................................................................... 45 3.2.3. Bước đầu xác định con lai bằng chỉ thị phân tử ............................................. 48 3.4.4. Khả năng chịu nhiệt cao của mô vảy củ của các dòng lily lai được tạo ra ............................................................................................................... 53 3.3. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng công nghệ gen ....................... 55 3.3.1. Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase ............ 55 3.3.2. Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily bằng A. tumefaciens ................................................................................................. 62 vii 3.3.3. Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily ....................................... 71 3.3.4. Khả năng chịu nóng các dòng lily chuyển gen .............................................. 73 3.3.5. Khả năng tích lũy glycine betaine ở một số dòng lily chuyển gen codA ....... 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................ 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 91 1. Kết luận ................................................................................................................ 91 2. Đề nghị .................................................................................................................. 92 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ................. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95 SUMMARY ........................................................................................................... 112 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 115 viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách tên và ký hiệu giống lily (Lilium spp.) sử dụng ................. 21 Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc ........ 23 Bảng 2.3. Tên và trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu .................. 23 Bảng 2.4. Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu .................... 23 Bảng 2.5. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................................................. 24 Bảng 2.6. Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây lily chuyển gen ........................ 24 Bảng 3.1. Hệ số tương đồng di truyền giữa 13 giống lily nghiên cứu ................ 37 Bảng 3.2. Sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ các giống lily sau 4 tuần nuôi cấy.............................................................. 40 Bảng 3.3. Tỷ lệ hữu dục và tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn các giống lily nghiên cứu ........................................................................................... 44 Bảng 3.4. Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn của các tổ hợp lai ..................................... 46 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA tới tỷ lệ nảy mầm và tạo củ in vitro từ hạt lai được tách ra từ lát cắt quả non ....................................................... 47 Bảng 3.6. Khả năng sống sót và khả năng tái sinh củ của lát cắt vảy củ 3 dòng lily lai và các dòng bố mẹ sau xử lý nhiệt (37oC ± 1oC, 13 ngày) .................................................................................................... 54 Bảng 3.7. Tên và trình tự đoạn mồi nhân đoạn promoter HSP18.2 của A. thaliana............................................................................................. 57 Bảng 3.8. Kết quả chuyển gen codA vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens ............... 60 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy củ đã biến nạp ...................................................................................... 64 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng sống của củ lily in vitro ................................................................................................. 65 Bảng 3.11. Khả năng chuyển gen của các chủng A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily ............................................................................................ 66 ix Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily ........................................................................... 67 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen vào lily .......................................................................................... 67 Bảng 3.14. Khả năng nhận các cấu trúc gen ở 3 giống lily nghiên cứu ................ 71 Bảng 3.15. Khả năng sống sót của các dòng lily chuyển gen in vitro sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) .......................................................... 74 Bảng 3.16. Khả năng sống sót của mô vảy củ in vitro của 8 dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) ............................ 75 Bảng 3.17. Khả năng sống sót tạo củ in vitro của lát cắt vảy củ của một số dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) ............. 76 Bảng 3.18. Mối quan hệ sự tích lũy glycine betain trong lá và một số đặc điểm khác của một số dòng lily in vitro .............................................. 77 x DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR 13 giống lily với mồi ISSR 8 (A), mồi ISSR 52 (B) .................................................................................. 37 Hình 3.2. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 13 giống lily ....... 38 Hình 3.3. Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC ± 1oC ...... 42 Hình 3.4. Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 42oC ± oC ....... 43 Hình 3.5. Sự tạo củ lily in vitro từ lát cắt vảy củ(A) và khả năng sống của củ lily in vitro trong điều kiện nhiệt độ cao(B) ................................... 44 Hình 3.6. Hạt phấn bắt màu thuốc nhuộm (A) và hạt phấn nảy mầm (B) .......... 45 Hình 3.7. Sự cứu phôi bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (A); nuôi cấy phôi (B) ................................................................................. 47 Hình 3.8. Sản phẩm PCR với mồi RAPD của các cặp bố mẹ và dòng con lai ......................................................................................................... 49 Hình 3.9. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 51(A) và ISSR 55(B) của tổ hợp Sor, Bel và 134 .................................................................................... 50 Hình 3.10. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 7 (a) và ISSR 55 (b) của tổ hợp Sor và L; L và F và các con lai .................................................................... 51 Hình 3.11. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa con lai và dòng bố mẹ ......... 53 Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm pBI121/35S-TP-codA-cmyc, pBI121/35S- codA-cmyc và pCAMBIA1301 sau khi cắt bởi enzym giới hạn HindIII, EcoRI (A) và sản phẩm tinh sạch các đoạn gen (B) ............... 55 Hình 3.13. Sơ đồ vùng T- DNA của pCAMBIA1301 tái tổ hợp chứa gen codA được điều khiển bởi promoter 35S CAMV ............................... 56 Hình 3.14. Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của các khuẩn lạc A. tumefaciens .......................................................................................... 57 Hình 3.15. Kết quả nhân đoạn (A) và tinh sạch (B) promoter HSP18.2 ............... 58 xi Hình 3.16. Sản phẩm cắt vector pCAMBIA1301/35S-TP-codA-cmyc/35S- GUS-Nos, promoter HSP18.2 bằng enzyme giới hạn HindIII, XbaI (A) và sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu(B) ............. 59 Hình 3.17. Sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen codA trong cây thuốc lá ........ 61 Hình 3.18. Chồi thuốc lá in vitro chuyển gen codA-cmyc (A ) và TP- codAcmyc (B) khi được xử lý X-gluc.................................................. 61 Hình 3.19. Hình ảnh điện di protein ở các dòng thuốc lá chuyển gen codA ......... 61 Hình 3.20. Cây thuốc lá trước (A) và sau (B) xử lý nhiệt (37 oC ± 1 oC, 21 ngày) ......... 62 Hình 3.21. Sự tái sinh củ in vitro từ lát cắt vảy củ lily đã biến nạp sau 4 tuần nuôi cấy ....................................................................................... 64 Hình 3.22. Củ lily in vitro trong môi trường có hygromycine sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................................... 64 Hình 3.23. Sự biểu hiện tạm thời gen GUS của lát cắt vảy củ sau biến nạp ........ 69 Hình 3.24. Sự biểu hiện gen GUS ở cây lily in vitro 8- 12 tuần tuổi .................... 69 Hình 3.25. Các bước chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily in vitro ...................................................................................... 69 Hình 3.26. Quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua vi khuẩn A. tumefaciens hiệu quả cao ................................................................ 70 Hình 3.27. Sự hình thành và phát triển củ lily in vitro của vảy củ được biến nạp tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycin, gen GUS và gen codA) ............................................................................... 72 Hình 3.28. Cây lily in vitro được chuyển tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycine, gen GUS và gen codA) bắt màu với thuốc nhuộm X-gluc .................................................................................................. 72 Hình 3.29. Ảnh điện di sản phẩm RT – PCR mẫu lily với mồi đặc hiệu gen codA (A) và gen TP-codA (B) .............................................................. 73 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng. Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao. Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này. Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử nghiệm một số giống lily vụ đông. Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp nhiều trở ngại. Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao, thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất lượng cây hoa thấp. Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010). Với nhiều phương pháp hiện đại đa