Luận án Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây Lan Hài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ***** VŨ QUỐC LUẬN XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU TRONG NGHIÊN CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY LAN HÀI (Paphiopedilum sp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ***** VŨ QUỐC LUẬN XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU TRONG NGHIÊN CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY LAN HÀI (Paphiopedilum sp.) Chuyên ngành Mã số : Khoa học cây trồng : 62.62.01.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt 2. TS. Đỗ Khắc Thịnh 2017 i LỜI CAM ĐOAN Các số liệu trong luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi và nhóm tác giả nghiên cứu từ năm 2010 cho tới nay trong các đề tài và dự án của phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên: (1) Đề tài cấp cơ sở chọn lọc, thực hiện năm 2011-2012: Bước đầu nghiên cứu tái sinh cây lan hài (Paphiopedilum sp.), theo quyết định số 26, ngày 14 tháng 03 năm 2011 của Viện Sinh Học Tây Nguyên. (2) Đề tài cấp cơ sở, thực hiện năm 2013-2014: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng đơn sắc lên quá trình sinh trưởng và phát triển in vitro và ex vitro của cây lan hài (Paphiopedilum sp.), theo quyết định số 19, ngày 25 tháng 02 năm 2013 của Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. (3) Đề tài cấp Quốc gia: Hệ thống chiếu sáng đơn sắc – nguồn sáng nhân tạo cho nghiên cứu tái sinh và nhân giống một số loại cây trồng nuôi cấy in vitro, mã số: 106.16-2012.32, do Quỹ Khoa học và Công nghệ Quốc Gia (NAFOSTED) thuộc bộ Khoa học và Công nghệ quản lý. (4) Dự án sản xuất cấp Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam: Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số lượng lớn dưới hệ thống chiếu sáng đơn sắc (LED) phục vụ nhu cầu của tỉnh Quảng Nam; nên tôi được phép sử dụng để báo cáo với những kết quả do chính tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này. Đà Lạt, ngày 22 tháng 02 năm 2017 Người cam đoan Vũ Quốc Luận ii LỜI CẢM ƠN Trong cuộc sống của mỗi con người, ai cũng phải có một ước mơ, một hoài bão, một lý tưởng cho riêng mình. Nhưng điều đó có thể thực hiện được hay không là do sự quyết tâm của bản thân, cũng như sự giúp đỡ tận tình về mặt vật chất cũng như tinh thần của những người xung quanh chúng ta. Từ những ngày chập chững tìm hiểu về nghiên cứu khoa học cho tới nay đã được 14 năm, một quãng thời gian không dài, nhưng nó cũng đủ để cho em hiểu “công việc của những người làm nghiên cứu khoa học luôn đầy dãy những khó khăn và thách thức”. Để thực hiện được ước mơ khám phá những điều mới lạ, chúng ta cần phải có một quãng thời gian đủ dài cùng với lòng say mê và làm việc một cách nghiêm túc. Cảm ơn Thầy Dương Tấn Nhựt đã giúp em bay cao hơn, xa hơn và thực hiện được những ước mơ, hoài bão, lý tưởng của mình. Thầy đã truyền cho em niềm say mê làm việc, say mê nghiên cứu khoa học, được làm những việc mình yêu thích là một niềm hạnh phúc vô cùng lớn. Cảm ơn Thầy Đỗ Khắc Thịnh (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam), đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện luận án. Cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện đề tài này. Cảm ơn toàn thể anh chị em tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên nơi tôi thực hiện các nội dung chính trong đề tài luận án, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này. Cuối cùng xin gởi lời cảm ơn thiêng liêng nhất đến gia đình, vợ, con luôn là nguồn động viên, an ủi, giúp đỡ trong suốt quá trình làm luận án. Đà Lạt, ngày 22 tháng 02 năm 2017 Tác giả luận án Vũ Quốc Luận iii MỤC LỤC Lời cam đoan ................................................................................................................ i Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ............................................................................................. xiii Danh mục bảng ........................................................................................................ xiv Danh mục hình ........................................................................................................xvii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài .......................................................... 3 5. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................... 3 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về lan hài (Paphiopedilum) ............................................................. 4 1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................................. 4 1.1.2. Nguồn gốc phân bố ........................................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm hình thái - đặc trưng của lan hài ...................................................... 5 1.1.4. Sinh thái ............................................................................................................ 8 1.1.5. Giá trị kinh tế của lan hài ............................................................................... 12 1.1.6. Sự suy thoái và tuyệt chủng của các loài lan hài ngoài tự nhiên ................... 13 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro của thực vật ..................................................................................................................... 13 1.2.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái của cây ............... 13 1.2.1.1. Tuổi của cây ................................................................................................. 14 1.2.1.2. Tuổi của mô và cơ quan ............................................................................... 14 1.2.1.3. Tình trạng sinh lý ......................................................................................... 14 1.2.1.4. Điều kiện phát triển ...................................................................................... 14 1.2.1.5. Vị trí của mẫu cấy ........................................................................................ 15 iv 1.2.1.6. Kích thước của mẫu cấy ............................................................................... 15 1.2.1.7. Vết thương .................................................................................................... 15 1.2.1.8. Phương pháp cấy ......................................................................................... 15 1.2.1.9. Ảnh hưởng của ánh sáng .............................................................................. 16 1.2.1.10. Ảnh hưởng của chất khoáng ...................................................................... 16 1.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật..................................................................................................... 17 1.3.1. Auxin ............................................................................................................... 17 1.3.2. Cytokinin ......................................................................................................... 17 1.3.3. Gibberellin ...................................................................................................... 17 1.4. Vai trò của ánh sáng đối với thực vật ............................................................. 19 1.4.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của thực vật ............................. 19 1.4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình quang hợp ........................................ 19 1.4.3. Ánh sáng và quang phát sinh hình thái ........................................................... 21 1.4.3.1. Thụ quan ánh sáng đỏ (phytochrome) ở thực vật ........................................ 21 1.4.3.2. Các thụ quan ánh sáng xanh dương ở thực vật ........................................... 21 1.4.4. Ánh sáng nhân tạo trong vi nhân giống cây trồng .......................................... 23 1.4.4.1. Cơ sở của việc sử dụng LED đỏ và LED xanh dương trong nghiên cứu ............. 25 1.4.4.2. Ảnh hưởng của đèn LED đến sinh lý cây trồng ........................................... 26 1.4.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED trong nuôi cấy in vitro ............. 27 1.5. Ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ đến quá trình sinh trưởng in vitro .......... 29 1.5.1. Ảnh hưởng của peptone đến quá trình sinh trưởng in vitro ........................... 29 1.5.2. Ảnh hưởng của bột khoai tây đến quá trình sinh trưởng in vitro ................... 29 1.5.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình sinh trưởng in vitro ......................... 30 1.5.4. Ảnh hưởng của bột chuối đến quá trình sinh trưởng in vitro ......................... 31 1.6. M t số nghiên c u tái sinh và nh n giống in vitro trên đối tượng lan hài .. 31 1.6.1. Các kết quả nghiên cứu về tái sinh và nhân giống trên đối tượng lan hài được công bố trên các tạp chí trong nước. ............................................................... 32 v 1.6.2. Các kết quả nghiên cứu tái sinh và nhân giống trên đối tượng lan hài được đăng trên các tạp chí ngoài nước.. .................................................................. 33 1.6.2.1. Phương pháp nhân giống truyền thống trên đối tượng lan hài ................... 33 1.6.2.2. Tái sinh và nhân giống bằng phương pháp gieo hạt ................................... 33 1.6.2.3. Tái sinh và nhân giống từ chồi đỉnh ............................................................ 36 1.6.2.4. Tái sinh và nhân giống thông qua mô sẹo và PLB....................................... 36 1.6.2.5. Tái sinh và nhân giống thông qua hình thành chồi trực tiếp ....................... 39 1.6.2.6. Tái sinh và nhân giống thông qua chồi nách ............................................... 39 1.6.2.7. Tái sinh và nhân giống bằng phương pháp gây vết thương ........................ 40 1.6.2.8. Tái sinh và nhân giống in vitro bằng phương pháp cắt đốt, cắt theo chiều dọc và ngang thân cây con in vitro ................................................................. 41 1.6.2.9. Tái sinh chồi và nhân giống từ phát hoa ..................................................... 42 1.6.2.10. Những ưu và nhược điểm của các phương pháp nhân giống lan hài ........ 42 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 44 2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 44 2.1.1. Nguồn mẫu từ hạt ............................................................................................ 44 2.1.2. Nguồn mẫu chồi non ....................................................................................... 44 2.1.3. Nguồn mẫu chồi non chồi non ngoài vườn ươm được kéo dài dưới nguồn sáng khác nhau .......................................................................................................... 44 2.1.4. Nguồn mẫu in vitro .......................................................................................... 46 2.1.5. Thiết bị - dụng cụ ............................................................................................ 46 2.1.6. Thiết bị chiếu sáng .......................................................................................... 46 2.1.6.1. Đèn huỳnh quang ......................................................................................... 46 2.1.6.2. Hệ thống chiếu sáng LED ............................................................................ 46 2.1.7. Giá thể trồng và điều kiện nuôi cấy in vitro và ex vitro ................................. 47 2.1.7.1. Giá thể trồng cây con ................................................................................... 47 2.1.7.2. Điều kiện chiếu sáng và nhiệt độ ................................................................. 48 2.2. Phương pháp nghiên c u ................................................................................. 48 2.2.1. Phương pháp gieo hạt ..................................................................................... 48 vi 2.2.2. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non .................................................... 48 2.2.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân .............................................. 48 2.2.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt ........................................................... 49 2.2.5. Phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo .................................................. 49 2.2.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt ..................... 49 2.2.7. Phương pháp hủy đỉnh .................................................................................... 49 2.2.8. Phương pháp gây vết thương .......................................................................... 50 2.3. N i dung nghiên c u ........................................................................................ 50 2.3.1. Phương pháp gieo hạt .................................................................................... 50 2.3.1.1. Thí nghiệm 1. Khả năng nảy mầm của hạt 3 loài lan hài trên các môi trường khoáng khác nhau ......................................................................................... 50 2.3.1.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng của chồi 3 loài lan hài nuôi cấy in vitro ........................................... 51 2.3.2. Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh ............................................... 51 Thí nghiệm 3. Khảo sát thời gian khử trùng chồi non của 3 loài lan hài ngoài vườn ươm ................................................................................................................... 51 2.3.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân ........................................... 51 2.3.3.1. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng thân của 3 loài lan hài ngoài vườn ươm .............................................. 52 2.3.3.2. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của mẫu cấy có nguồn gốc từ các điều kiện chiếu sáng khác nhau đến khả năng tái sinh chồi in vitro của 3 loài lan hài........... 52 2.3.3.3. Thí nghiệm 6. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy đốt thân ngoài vườn ươm 3 loài lan hài ..................................................... 52 2.3.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt ......................................................... 53 2.3.4.1. Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng kéo dài chồi in vitro của 3 loài lan hài ............................................................ 53 2.3.4.2. Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 lên khả năng kéo dài chồi in vitro của 3 loài lan hài ................................................................................... 54 vii 2.3.4.3. Thí nghiệm 9. Kéo dài chồi in vitro của 3 loài lan hài trong điều kiện che tối hoàn toàn và khả năng sống sót của các đốt thân ngoài vườn ươm ............. 54 2.3.5. Phương pháp nhân giống thông qua mô sẹo ................................................ 55 2.3.5.1. Thí nghiệm 10. Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân ngoài vườn ươm được kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 loài lan hài ............. 55 2.3.5.2. Thí nghiệm 11. Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến quá trình nhân nhanh mô sẹo trên loài lan Vân hài .......................................................................... 55 2.3.5.3. Thí nghiệm 12. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA với BA và TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo trên loài lan Vân hài ..................................... 56 2.3.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt ................. 57 2.3.6.1. Thí nghiệm 13. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng tạo PLB trên loài lan hài ......................................................................................................... 57 2.3.6.2. Thí nghiệm 14. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với TDZ, BA và KIN lên quá trình nhân nhanh PLB trên loài lan hài ............................................................. 57 2.3.6.3. Thí nghiệm 15. Ảnh hưởng của nguồn gốc PLB khác nhau lên khả năng hình thành chồi trên loài lan hài ...................................................................... 57 2.3.7. Phương pháp hủy đỉnh .................................................................................. 59 Thí nghiệm 16. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh lên khả năng tạo chồi bên của 3 loài lan hài ............................................................ 59 2.3.8. Phương pháp gây vết thương......................................................................... 60 Thí nghiệm 17. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương đến khả năng kích thích tạo chồi bên của 3 loài lan hài .............................. 60 2.3.9. Ảnh hưởng của các hợp chất bổ sung lên quá trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro .................................................................................................. 60 2.3.9.1. Thí nghiệm 18. Ảnh hưởng của nước dừa non đến quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro ......................................................................... 60 2.3.9.2. Thí nghiệm 19. Ảnh hưởng của bột khoai tây lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro ..................................................................................... 61 viii 2.3.9.3. Thí nghiệm 20. Ảnh hưởng của peptone lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro ............................................................................................ 61 2.3.9.4. Thí nghiệm 21. Ảnh hưởng của bột chuối lên quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro ............................................................................................ 62 2.3.10. Trồng cây con 3 loài lan hài ra điều kiện vườn ươm ................................. 62 Thí nghiệm 22. Ảnh hưởng của giá thể đến quá trình sinh trưởng cây con 3 loài lan hài ........................................................................................................................ 62 2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu ............................................ 63 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 64 3.1. Phương pháp gieo hạt ...................................................................................... 64 3.1.1. Khả năng nảy mầm của 3 loài lan hài trên các môi t