Luận án Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes Elongatus)

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cần Thơ, 2016 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần Thơ, 2016 i LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành các nội dung cơ bản trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ không nhỏ từ nhiều tổ chức, cơ quan và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành biết ơn tới Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, quý thầy, cô Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS Đặng Thị Hoàng Oanh đã trực tiếp, hướng dẫn, tận tình dìu dắt và đóng góp ý kiến quý báu để giúp tôi hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy sản đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tại Bộ môn. Cám ơn các em học viên Cao học và các em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Sở Nông nghiệp & PTNT, Trung tâm Khuyến nông Khuyến ngư Bạc Liêu đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tại Trường Đại học Cần Thơ. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp những người đã góp ý, chia sẻ chân thành, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa học. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã tạo mọi điều kiện để tôi vượt qua khó khăn, trở ngại trong suốt quá trình học tập và làm việc. TÁC GIẢ ii TÓM TẮT Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) đã gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi. Qua kết quả điều tra phỏng vấn trực tiếp 90 hộ nuôi ở Bạc Liêu cho thấy, mật độ nuôi cá bống kèo dao động từ 100 – 150 con/m2, trong suốt thời gian nuôi hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước, xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Cá tập trung bệnh ở giai đoạn 02 tháng tuổi với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và trên diện rộng, ảnh hưởng đến năng suất và lợi nhuận của người nuôi. Kết quả phân lập vi khuẩn sau 6 lần thu mẫu đã thu được 252 khuẩn lạc, tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn thu được là vi khuẩn Gram (+), hình tròn, không di động, oxidase và catalase âm tính. Sau khi tiến hành định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep và phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Streptococcus dysgalactiae. Quy trình PCR sử dụng đoạn mồi STRD-DyI/dys-16S-23S-2 được chuẩn hóa để chẩn đoán nhanh S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. Kết quả xác định liều lượng gây chết LD50 của vi khuẩn là 4,25 x 10 4 CFU/ml. Vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nhạy cao với kháng sinh florfenicol và doxycycline. Kết quả điều trị trong phòng thí nghiệm cho thấy khi gây cảm nhiễm cá bống kèo bằng chủng vi khuẩn B1-6T với liều lượng vi khuẩn 4,25 x 104 CFU/cá, sử dụng 02 loại thuốc kháng sinh florfenicol và doxycycline ở liều lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá, sau 21 ngày theo dõi cả hai loại kháng sinh trên (ở dạng nguyên liệu và thành phẩm) đều cho tỷ lệ điều trị đạt cao, tỉ lệ sống của cá đạt từ 65,56 % – 71,11 %, giá trị RPS (%) đạt từ 45,27% – 61,16 %. iii ABSTRACT Hemorrhagic disease has caused huge losses in the cultured mudskipper (Pseudapocryptes elongates). Result interviewed 90 farmers in Bac Lieu province showed that the farmers culture mudskipper density from 100-150 fish/m 2 , almost no change water but they add water in the pond, they use chemical processing and microbiology for improving farming environment. Fish concentrate disease stage 02 months old with clinical signs of hemorrhage in the body, at the fin and anal with a high mortality rate and widespread, affecting the productivity and profitability of farmers. Results were obtained sampling 252 colonies after 6 times collecting bacteria sample, examined some basic biochemical indicators of bacteria showed that bacterial is Gram (+), cocci, non-motile, oxidase and catalase-negative. After conducting identification of bacteria by API 20 Strep kit and method of 16S rRNA gene sequence analysis has identified the bacteria is Streptococcus dysgalactiae. PCR using primers STRD-DYI/dys-16S-23S-2 is standardized to provide rapid diagnosis pathogenic S. dysgalactiae in hemorrhage mudskipper. The results determine the LD50 in lethal doses of bacteria is 4.25 x 10 4 CFU/ml. S. dysgalactiae bacteria were sensitized with florfenicol and doxycycline. The results of treatment in the laboratory showed that when the mudskippers are causing susceptibility by strain B1-6T with dose 4.25 x 10 4 CFU/fish, use florfenicol and doxycycline in dose 20 mg/kg fish, after 21 days, the result of the experiment showed that two kinds of antibiotics (materials and products) are for reaching higher treatment rates, survival rate is from 65.56% - 71.11%, the value RPS (%) was from 45.27% - 61.16%. iv CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài ‟Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes lanceolatus) nuôi thương phẩm và đề xuất giải pháp phòng, trị” (Mã số: B2013- 16-29) do Bộ Giáo dục và Đào tạo tài trợ. Đề tài có quyền sử dụng kết quả luận án này để phục vụ cho đề tài. Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Tác giả Nguyễn Thu Dung v MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ ............................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................... ii Abstract ................................................................................................................. iii Cam kết kết quả .................................................................................................... iv Chƣơng I: Giới thiệu ........................................................................................... 1 1.1 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 1.2 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 1.4 Giới hạn nghiên cứu ......................................................................................... 3 1.5 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................... 3 1.6 Điểm mới của luận án ...................................................................................... 3 Chƣơng II: Tổng quan tài liệu ............................................................................ 4 2.1 Phân loại cá bống kèo ...................................................................................... 4 2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước ................................. 4 2.2.1 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới ...................................................... 4 2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nước ........................................................ 5 2.3 Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo...................................................... 5 2.4 Bệnh xuất huyết ở cá........................................................................................ 6 2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................................... 6 2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học ................................................................................. 6 2.4.3 Đặc điểm huyết học ...................................................................................... 7 2.5 Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá ......................................... 8 2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 8 2.5.2 Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas ................................................................. 10 2.5.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus ................................................................. 11 2.5.4 Bệnh do vi khuẩn Flexibacter ..................................................................... 12 2.5.5 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas ..................................................................... 13 2.5.6 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ................................................................. 15 2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nước lợ, mặn ........... 16 2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae........................................................ 17 2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ............................................... 18 2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae ........................................... 19 2.6.4 Cơ chế gây bệnh.......................................................................................... 20 2.6.5 Phương thức lây truyền bệnh trong môi trường nuôi ................................. 20 2.6.6 Phương thức chẩn đoán .............................................................................. 21 2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá ... 21 vi 2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá .................................................................... 22 2.9 Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá .................................................................. 23 2.9.1 Hóa chất ...................................................................................................... 23 2.9.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 23 2.9.3 Vắc xin ........................................................................................................ 25 Chƣơng III: Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 27 3.1.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 27 3.1.2 Hóa chất ...................................................................................................... 27 3.1.3 Môi trường .................................................................................................. 27 3.1.4 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 28 3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện .................................................................. 28 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 28 3.2.1 Điều tra phỏng vấn ...................................................................................... 28 3.2.2 Phương pháp thu mẫu cá............................................................................. 29 3.2.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng ........................................................... 29 3.2.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn ........................................................ 29 3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ................................. 32 3.2.6 Phương pháp mô bệnh học ......................................................................... 33 3.2.7 Phương pháp huyết học .............................................................................. 33 3.2.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết ........................................ 34 3.2.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 37 3.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 38 3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 41 Chƣơng IV: Kết quả và thảo luận .................................................................... 42 4.1 Khảo sát tình hình nuôi cá bống kèo ............................................................. 42 4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo .......................................................................... 42 4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo nuôi thương phẩm .................................. 49 4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo ........................................... 50 4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết .............. 51 4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 51 4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo .......................................................................................... 52 4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep .................................... 53 4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ..................... 53 4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo................... 55 4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ................ 55 4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ......................... 58 4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh ................................................ 63 vii 4.5 Phát triển quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................................. 69 4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá ........................................ 69 4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn ............................................................... 69 4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae ......................................................................... 69 4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 70 4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 71 4.6 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................................................... 72 4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ....... 72 4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ................................................................... 77 4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50 ................................................... 80 4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm .................... 82 Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất ......................................................................... 86 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 86 5.1.1 Kết quả điều tra ........................................................................................... 86 5.1.2 Kết quả nghiên cứu ..................................................................................... 86 5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 88 1. Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 88 2. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 100 PHỤ LỤC .......................................................................................................... 106 Phụ lục A: Phiếu điều tra ao nuôi ...................................................................... 106 Phụ lục B: Hóa chất và phương pháp phân tích mẫu......................................... 108 Phụ lục B.1: Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn .............. 108 Phụ lục B.2: Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ............. 108 Phụ lục B.3: Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh .......................................................................... 109 Phụ lục C: Số liệu nghiên cứu ........................................................................... 112 Phụ lục C.1: Kết quả điều tra ............................................................................. 112 Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn ......................................... 121 Phụ lục C.3: Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ................................... 141 Phụ lục C.4: Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn .................................. 142 Phụ lục C.5: Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo ......................................... 154 Phụ lục C.6: Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................... 157 viii Phụ lục C.7: Kết quả thí nghiệm LD50 ............................................................... 158 Phụ lục C.8: Kết quả thí nghiệm điều trị ........................................................... 160 ix DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio ............................. 9 Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas .............................. 10 Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Streptococcus ............................... 12 Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Flexibacter ................................... 13 Bảng 2.5 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Aeromonas ................................... 14 Bảng 2.6 Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri ..................................... 15 Bảng 3.1 Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep ................ 32 Bảng 3.2 Đường kính vô trùng của một số kháng sinh ....................................... 38 Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo ........................................... 42 Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo ................................................................... 43 Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao ........................................................................... 45 Bảng 4.4 Mật độ thả giống .................................................................................. 46 Bảng 4.5 Tỷ lệ cá chết ......................................................................................... 50 Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo ................... 51 Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu ........ 52 Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI ..... 54 Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết ............... 65 Bảng 4.10 Số lượng