Luận văn Ảnh hưởng của florfenicol lên sinh hóa, huyết học và tồn lưu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong bể

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM NGỌC ẢNH HƯỞNG CỦA FLORFENICOL LÊN SINH HÓA, HUYẾT HỌC VÀ TỒN LƯU TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG BỂ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2009 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM NGỌC ẢNH HƯỞNG CỦA FLORFENICOL LÊN SINH HÓA, HUYẾT HỌC VÀ TỒN LƯU TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG BỂ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG 2009 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Luận văn kèm theo đây với tựa đề là “ẢNH HƯỞNG CỦA FLORFENICOL LÊN SINH HÓA, HUYẾT HỌC VÀ TỒN LƯU TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG BỂ” do Lê Kim Ngọc thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm luận văn thông qua. Ủy viên Ủy viên, thư ký Phản biện 1 Phản biện 2 Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2009 Chủ tịch Hội đồng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM TẠ Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGs.Ts. Nguyễn Thanh Phương đã quan tâm, động viên và hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian triển khai thí nghiệm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp; đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi và cơ hội học tập nâng cao sự hiểu biết. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ts. Đỗ Thị Thanh Hương, Ts.Nguyễn Văn Công về những lời khuyên quý báu và sự hướng dẫn nhiệt tình trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn Ts. Huỳnh Thị Tú, Ths. Vương Thanh Tùng, Ks. Trần Minh Phú đã hướng dẫn và hỗ trợ tôi về kỹ thuật phân tích mẫu. Cảm ơn bạn Nguyễn Hương Thùy và bạn Nguyễn Thị Kim Hà, cán bộ Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm. Xin được gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên lớp Nuôi trồng Thủy sản K30 và Bệnh học Thủy sản K31 đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn Dự án Physcam, Đề tài Nghị định thư Việt-Bỉ đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện giúp tôi nâng cao kiến thức và tiếp cận kỹ thuật nghiên cứu chuyên sâu. Xin được gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc Sở Nông nghiệp và PTNT Hậu Giang, Lãnh đạo Chi cục Thủy sản Hậu Giang, các anh, chị và các bạn đồng nghiệp đã quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Cám ơn các anh, chị lớp Cao học Nuôi trồng Thủy sản K13 đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Xin Chân thành cảm ơn. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Ảnh hưởng của kháng sinh florfenicol lên các chỉ tiêu sinh hóa, huyết học và sự tồn lưu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống có trọng lượng 15-20 g/con được thực hiện tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 4-10/2008. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần trong hệ thống bể composite có sục khí liên tục, mật độ 70 con/bể 500 L. Cá được cho ăn thức ăn có chứa florfenicol với liều lượng 0, 10, 30 và 100 mg/kg khối lượng thân/ngày, liên tục trong 7 ngày. Các chỉ tiêu sinh hóa (enzyme ChE, LPO, GST và CAT ở cơ, gan, mang và não), huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, hematocrit, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC và ion Na+, K+, Cl- trong huyết tương) và tồn lưu được thu tại các thời điểm 0 ngày (chưa ăn kháng sinh); 1, 4, 7 ngày (ăn kháng sinh); 1, 5, 14, 28 ngày (ngưng ăn kháng sinh). Kết quả cho thấy florfenicol gây ức chế hoạt tính ChE ở não và gan, đồng thời làm tăng hoạt tính LPO, GST và CAT ở mô não, mang, gan và cơ. Sau khi cá ngưng ăn kháng sinh, hoạt tính các enzyme này có xu hướng phục hồi, mức độ và thời gian phục hồi phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh và loại mô. Số lượng hồng cầu, bạch cầu, hematocrit giảm và phục hồi sau khi cá ngưng ăn kháng sinh 1-5 ngày tùy lượng kháng sinh cá đã ăn. Ngoài ra, các chỉ tiêu MCV, MCH, hemoglobin, MCHC và ion Na+, K+ và Cl- trong huyết tương có sự biến động nhưng không đáng kể so với đối chứng. Mức tồn lưu florfenicol trong cơ cá chỉ phát hiện được ở duy nhất 1 nghiệm thức là NT-100 tại thời điểm cá ăn kháng sinh 7 ngày với mức 336 ppb, sau khi cá ngưng ăn kháng sinh không còn phát hiện florfenicol tồn lưu trong cơ cho đến khi kết thúc thí nghiệm, kết quả này cho thấy thời gian đào thải florfenicol khỏi cơ thể cá khá nhanh. Hơn nữa, sử dụng florfenicol liên tục 7 ngày không ảnh hưởng đến tăng trưởng cá tra giống 20-30 g/con. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii ABSTRACT The effect of florfenicol on biochemistry, hematology and residue on stripped catfish (Pangasianodon hyppophthalmus) fingerlings (15-20 g/fish) was studied in College of Aquaculture and Fisheries, Cantho University from April to October 2008. The experiment was randomly designed and triplicated in continuously aerated composite tank system. Fish were stocked at density of 70 individuals per 500 liters tank. They were fed with daily diets containing 0, 10, 30 and 100 mg florfenicol/kg body weight in consecutive 7 days. The parameters of biochemistry (enzyme ChE, LPO, GST and CAT in muscle, liver, gill and brain), hematology (quantity of red blood cell (RBC) and white blood cell (WBC), hematoctit, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC and ion Na+, K+, Cl- in plasma) and residue of florfenicol in muscle were sampled at zero day (feeding without florfenicol); 1st, 4th, 7th day (feeding with florfenicol); and 1st, 5th, 14th, 28th day (after stopping feeding with florfenicol). The result shows that florfenicol inhibits the ChE activity in brain and liver; and at the same time increases LPO, GST and CAT activities in brain, gill, liver and muscle. These enzyme activities tend to recover after the feeding with florfenicol has been stopped. The degree and time of recovery depend on florfenicol concentration and type of tissue. The quantity of RBC and WBC and hematocrit value are decreased, but then it can be recovered in 1-5 days after non-feeding with florfenicol. However, this completely depends on the amount of florfenicol that fishes have eaten. In addition, the other of hematological parameters such as MCV, MCH, hemoglobin, MCHC and ion Na+, K+, Cl- in plasma are changed lightly, and non-significant with the control. The florfenicol residue in muscle is only detected in treatment 4 at 7 th contamination day with the residue concentration of 336 ppb. Right after fishes have been fed without florfenicol, the florfenicol is no longer found in muscle until the experiment ends. The result indicates that the florfeniol residue was depleted from fish body rather fast. Moreover, the using florfenicol in consecutive 7 days cause no effect to the growth of Pangasianodon hypophthalmus fingerlings (20-30 g/fish). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ dự án Physcam và đề tài Nghị định thư giữa Việt Nam và Bỉ, các kết quả này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Dự án có quyền sử dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho dự án. Cần Thơ, ngày 14 tháng 10 năm 2009 Ký tên Lê Kim Ngọc Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ............................................................................................... i TÓM TẮT.................................................................................................... ii ABSTRACT ................................................................................................ iii LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................... iv MỤC LỤC.................................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG................................................................................. vii DANH SÁCH HÌNH................................................................................. viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................... ix Chương 1 GIỚI THIỆU .............................................................................. 1 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3 2.1 Một số nghiên cứu sinh hoá trên cá ..................................................... 3 2.1.1 Sơ lược về vai trò của các enzyme............................................ 3 2.1.2 Một số nghiên cứu sinh hoá trên cá .......................................... 5 2.2 Một số nghiên cứu về huyết học trên các đối tượng thủy sản nuôi .............................................................................................. 9 2.2.1 Thành phần cấu tạo và vai trò của máu..................................... 9 2.2.2 Một số nghiên cứu về huyết học trên cá.................................. 11 2.3 Tình hình sử dụng hoá chất, kháng sinh và một số nghiên cứu về kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ..................................... 13 2.4 Florfenicol và một số nghiên cứu sử dụng Florfenicol trong điều trị bệnh cá ........................................................................ 14 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 19 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 19 3.2 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 19 3.3 Cá thí nghiệm ................................................................................... 19 3.4 Thức ăn............................................................................................. 19 3.5 Bố trí thí nghiệm............................................................................... 19 3.6 Phương pháp thu và phân tích mẫu ................................................... 21 3.6.1 Phương pháp thu mẫu............................................................. 21 3.6.2 Thời gian thu mẫu .................................................................. 21 3.6.3 Phương pháp phân tích mẫu ................................................... 22 3.7. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................ 32 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 33 4.1 Nồng độ kháng sinh trong thức ăn và mức độ tiêu thụ thức ăn của cá ................................................................................... 33 4.2 Kết quả theo dõi các yếu tố môi trường............................................. 33 4.2.1 Nhiệt độ, pH và Oxy hòa tan .................................................. 33 4.2.3 Nitrite, nitrate và tổng đạm amon ........................................... 34 4.3 Ảnh hưởng của FF đến một số chỉ tiêu sinh hóa................................ 36 4.3.1 Enzyme Cholinesterase (ChE)................................................ 36 4.3.2 Enzyme Lipid Peroxidation (LPO) ......................................... 39 4.3.3 Enzyme Glutathione S-tranferase (GST) ................................ 41 4.3.4 Enzyme Catalase (CAT)......................................................... 44 4.4 Ảnh hưởng của FF đến một số chỉ tiêu huyết học.............................. 46 4.4.1 Số lượng hồng cầu.................................................................. 46 4.4.2 Số lượng bạch cầu.................................................................. 48 4.4.3 Tỷ lệ huyết sắc tố (Hematocrit) .............................................. 49 4.4.4 Số lượng huyết sắc tố (Hemoglobin) ...................................... 50 4.4.5 Thể tích hồng cầu - MCV....................................................... 52 4.4.6 Trọng lượng trung bình huyết sắc tố trong hồng cầu – MCH.. 53 4.4.7 Nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu – MCHC ...................... 54 4.4.8 Nồng độ ion Na+, Cl- và K+ trong huyết tương ....................... 55 4.5 Sự tồn lưu kháng sinh FF trong cơ cá................................................ 56 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...................................................... 58 5.1 Kết luận.............................................................................................. 58 5.2 Đề xuất............................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 60 PHỤ LỤC A ............................................................................................... 65 PHỤ LỤC B ............................................................................................... 66 PHỤ LỤC C ............................................................................................... 70 PHỤ LỤC D ............................................................................................... 71 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Qui trình phân tích ChE................................................................ 23 Bảng 3.2: Qui trình phân tích CAT ............................................................... 24 Bảng 3.3: Qui trình phân tích GST ............................................................... 26 Bảng 3.4: Qui trình lập đường chuẩn và phân tích LPO ................................ 27 Bảng 3.5: Qui trình phân tích Protein............................................................ 28 Bảng 4.1: Thức ăn cá tiêu thụ trong thời gian cho ăn kháng sinh (7 ngày) .... 33 Bảng 4. 2: Biến động nhiệt độ, pH và oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm33 Bảng 4.3: Biến động số lượng hồng cầu (triệu tế bào/mm3) .......................... 46 Bảng 4.4: Biến động số lượng bạch cầu (nghìn tb/mm3) ............................... 48 Bảng 4.5: Biến động tỷ lệ huyết sắc tố - hematocrit (%) ............................... 49 Bảng 4.6: Biến động số lượng huyết sắc tố - hemoglobin (mM/L) ................ 51 Bảng 4.7: Biến động thể tích hồng cầu – MCV (µm3) ................................... 52 Bảng 4.8: Biến động trọng lượng huyết sắc tố_MCH (pg) ............................ 53 Bảng 4.9: Biến động nồng độ huyết sắc tố - MCHC (%)............................... 54 Bảng 4.10: Biến động giá trị Na+, K+ và Cl- trong huyết tương ..................... 55 Bảng 4.11: Nồng độ kháng sinh florfenicol tồn lưu trong cơ cá .................... 56 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu viii DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm ................................................................. 20 Hình 3.2: Buồng đếm Neubauer.................................................................... 29 Hình 3.3: Vị trí đếm hồng cầu, bạch cầu trên buồng đếm Neubauer.............. 29 Hình 3.4: Cách làm kính phết ....................................................................... 30 Hình 4.1: Biến động NO2- qua các đợt thu mẫu............................................. 34 Hình 4.2: Biến động NO3- qua các đợt thu mẫu............................................. 35 Hình 4.3: Biến động TAN qua các đợt thu mẫu ............................................ 36 Hình 4.4: Hoạt tính ChE ở não, cơ, mang, gan cá qua các đợt thu mẫu ......... 37 Hình 4.5: Hoạt tính LPO ở não, cơ, mang, gan cá qua các đợt thu mẫu......... 40 Hình 4.6: Hoạt tính GST ở não, cơ, mang, gan cá qua các đợt thu mẫu......... 43 Hình 4.7: Hoạt tính CAT ở não, cơ, mang, gan cá qua các đợt thu mẫu ........ 45 Hình 4.8: Khối lượng trung bình (g) của cá qua các đợt thu mẫu .................. 57 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AChE Acetylcholinesterase AOZ 3-amino-2-oxazolidinone (dẫn xuất của Furazolidone) ATChI Acetylthiocholine Iodide BChE Butyl cholinesterase BSA Albumine Bovine CAP Chloramphenicol CAT Catalase CDNB 1-chloro-2,4-dinitrobenzene ChE Cholinesterase Cl- Chloride Cmax Nồng độ tối đa trong huyết tương Cty TNHH TM Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Thương mại ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DMSO Dimethyl Sulfoxide DO Dissolved oxygen DTNB Dithiobisnitoobenzoate EU Europe F Sinh khả dụng (% lượng thuốc đi vào hệ tuần hoàn) FB1 Aflatoxin B1 (độc chất từ loài nấm mốc giống Aspergillus) FF Florfenicol FFA Florfenicol amine GSH Glutathione GSH-Px Glutathione peroxidase GST Glutathione S-tranferase HAE 4-Hydroxyalkenals Hb Hemoglobin K+ Potassium LC50 Lethal Concentration 50% LOOHs Lipid hydroperoxides LOQ Limit of analytical quantitation LPO Lipid peroxidation MCH Mean Corpuscular Haemoglobin MCHC Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration MCV Mean Corpuscular Volumn MDA Malondialdehyde bis dimethyl acetal MIC Minimal Inhibition concentration MRL Maximum Residue Limit Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu x Na+ Sodium NO2- Nitrite NO3- Nitrate NT-10 Nghiệm thức 2: 10 mg FF/kg cá/ngày NT-100 Nghiệm thức 4: 100 mg FF/kg cá/ngày NT-30 Nghiệm thức 3: 30 mg FF/kg cá/ngày NT-ĐC Nghiệm thức 1: đối chứng NTTS Nuôi trồng Thủy sản PCV Packed Cell Volumn PTNT Phát triển Nông thôn RBC Red Blood Cell ROS Rective Oxygen Species SOD Superoxyde dimutase t ½ Thời gian bán thải (The terminal half-life) TAN Total Ammonia Nitrogen tb Tế bào TBA 2-Thiobarbituric A-xit TBARS Thiobarbituric A-xit Reactive Substance TCA Trichloroacetic A-xit TiOSO4 Titanium Oxysulfate tmax Thời gian đạt nồng độ tối đa trong huyết tương WBC White Blood Cell LC-MS/MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 Chương 1 GIỚI THIỆU Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) phân bố tự nhiên ở một số nước thuộc khu vực Đông Nam Châu Á như Campuchia, Thái Lan, Việt Nam…. Đây là loài cá nuôi quan trọng và mang lại giá trị kinh tế cao. Ở Việt Nam cá tra được nuôi rất phổ biến, đặc biệt là ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Vĩnh Long,... Mỗi năm diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL đều tăng, theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến tháng 8/2009, toàn vùng có tổng diện tích nuôi cá tra là 5.154 ha. So với năm 2000, diện tích này đã tăng khoảng 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới. Tổng sản lượng cá tra toàn vùng đến 14/8/2009 là 456.775 tấn với tốc độ tăng bình quân trong 8 tháng đầu năm 2009 là 13,5% (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2009). Với xu hướng phát triển về diện tích và quy mô trong thời gian qua, mức độ thâm canh hoá ngày càng cao và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên nghiêm trọng, dịch bệnh xảy ra khắp nơi gây nhiều khó khăn và thiệt hại không nhỏ cho người nuôi cá tra. Đối phó với tình hình này người dân đã sử dụng hàng loạt các loại thuốc kháng sinh, hoá chất kể cả hoá chất, kháng sinh cấm hoặc hạn chế sử dụng để ngăn ngừa và điều trị bệnh cá. Hơn nữa, đa phần người dân chưa hiểu rõ cách sử dụng cũng như chưa quan tâm đến sự ảnh hưởng của hoá chất, kháng sinh lên sinh trưởng và phát triển của cá, cũng như ảnh hưởng đến môi trường sinh thái và đặc biệt là tác động đến chất lượng sản phẩm khi thu hoạch. Vấn đề lạm dụng hoá chất, kháng sinh