Luận văn Áp dụng phương pháp VNTR - MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium Tuberculosis phân lập tại Việt Nam

~ 4 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Bệnh lao 1.1.1. Bệnh lao xét ở mức độ toàn cầu và ở Việt Nam 1.1.1.1. Gánh nặng bệnh lao trên thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới WHO năm 2009 (35), hiện nay lao đang là bệnh có tỷ lệ mắc phải và tỷ lệ tử vong cao, cả thế giới có khoảng 1,9 tỷ người nhiễm lao (1/3 dân số thế giới), mỗi năm có thêm 8-9 triệu người nhiễm lao, tương đương tỷ lệ 139/100,000 dân, 14,4 triệu người bệnh lao cũ và mới lưu hành và 1,7 triệu người chết do lao, trong đó 0,2 triệu người nhiễm HIV. 0,5 triệu trường hợp mắc lao kháng đa thuốc. Số người bệnh lao chủ yếu tập trung ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nam phi và Nigeria. Số người chết do lao ở các nước đang phát triển chiếm đến 98% tổng số người chết vì lao trên thế giới. Đặc biệt 80% trong số tử vong đó là trong lứa tuổi lao động, nguồn nhân lực chính sản xuất ra của cải vật chất cho xã hội (15-50 tuổi). Theo dự đoán của các nhà khoa học, trong 20 năm tới 200 triệu người có nguy cơ phát bệnh nếu vẫn giữ điều kiện sống như hiện nay. 1.1.1.2. Gánh nặng bệnh lao ở Việt Nam Theo WHO 2009, Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 quốc gia có tỷ lệ lao cao trên thế giới Dân số 86,2 triệu dân Tỷ lệ người bệnh lao mới các thể 173/100,000 dân Tỷ lệ người bệnh lao phổi AFB+ mới 77/100,000 dân Tỷ lệ hiện mắc các thể 225/100,000 dân Tỷ lệ tử vong do lao 23/100,000 dân Tỷ lệ người bệnh lao mới nhiễm HIV 5,0% Tỷ lệ kháng đa thuốc ở người bệnh lao mới 2,7% Tỷ lệ kháng đa thuốc ở người bệnh lao đã điều trị 19% ~ 5 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1.1.2. Phân loại bệnh lao (7) Năm 1882 Robert Koch xác định tác nhân gây bệnh lao là Mycobacterium tuberculosis. Trong tất cả các thể lao, lao phổi là thể lao phổ biến nhất (chiếm 80 – 85%) và là nguồn lây bệnh lao cho người xung quanh. Hiện nay phần lớn bệnh nhân lao có thể được chữa trị khỏi. Tuy nhiên, vấn đề của bệnh lao là không được chẩn đoán kịp thời. Xét nghiệm chuẩn để phát hiện nhiễm vi khuẩn lao là nuôi cấy vi khuẩn lao trong phòng thí nghiệm từ mẫu bệnh phẩm; tuy nhiên, phương pháp này mất hàng tuần có khi hàng tháng nếu nuôi cấy trên môi trường thạch đặc. Các phương pháp nuôi cấy lỏng hiện đại đã có thể khẳng định kết quả chẩn đoán trong vòng 1-2 tuần. Hiện nay, phương pháp nhanh nhất để phát hiện vi khuẩn lao là phương pháp soi đờm, nhuộm Ziel-Neelsen, có thể trả kết quả trong vòng vài giờ. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi tải lượng vi khuẩn lao cao, ít nhất khoảng 10 000 tế bào/mL mẫu đờm, trong đó hơn 50 % bệnh nhân âm tính mẫu đờm đã cho kết quả dương tính nuôi cấy. 1.1.2.1. Lao phổi AFB(+) : một ca lao bệnh phổi AFB (+) được xác định phải thoả mãn một trong ba tiêu chuẩn sau: - Tối thiểu có 2 tiêu bản AFB (+) từ 2 mẫu đờm khác nhau - Một tiêu bản đờm AFB (+) và có hình ảnh trên phim Xquang phổi nghĩ đến lao tiến triển - Một tiêu bản đờm AFB (+) và nuôi cấy dương tính. Riêng đối với người bệnh HIV(+) chỉ cần có ít nhất một tiêu bản xét nghiệm đờm AFB(+) được coi là lao phổi AFB(+). 1.1.2.2. Lao phổi AFB (-): một ca lao bệnh phổi AFB (-) phải thoả mãn một trong hai tiêu chuẩn sau: - Kết quả xét nghiệm đờm AFB âm tính ít nhất 6 mẫu đờm khác nhau qua 2 lần khám cách nhau khoảng 2 tuần, có tổn thương nghi lao tiến triển trên phim Xquang phổi và được bác sỹ chuyên khoa tuyến tỉnh chẩn đoán. - Kết quả xét nghiệm đờm AFB âm tính nhưng nuôi cấy dương tính. ~ 6 ~ …………………………………………………………………………………………………. Riêng đối với người bệnh HIV(+) chỉ cần ≥ 2 tiêu bản đờm AFB(-), điều trị kháng sinh phổ rộng không thuyên giảm, có hình ảnh Xquang phổi nghi lao và bác sỹ chuyên khoa lao quyết định được coi là Lao phổi AFB (-). 1.1.2.3. Lao ngoài phổi Bệnh nhân có các dấu hiệu lâm sàng, cận lâm sàng nghi lao ở các cơ quan tương ứng, và một trong các điều kiện sau: - Có kết quả nuôi cấy dương tính từ bệnh phẩm tổn thương cơ quan tương ứng - Có kết quả chẩn đoán mô tế bào bệnh thuộc các cơ quan tương ứng - Có chẩn đoán từ các thầy thuốc chuyên khoa tuyến tỉnh * Các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện các triệu chứng lâm sàng ở bệnh lao (2): - yếu tố cơ địa: tuổi tác, tình trạng miễn dịch (tình trạng suy giảm miễn dịch, suy dinh dưỡng, yếu tố di truyền), đồng nhiễm những bệnh khác, chủng ngừa BCG (bacillus Calmette-Guérin) - yếu tố vi sinh vật: độc lực của vi sinh vật, sự tấn công vào các mô, cơ quan chuyên biệt - tương tác vật chủ-vi sinh vật: vị trí xảy ra tương tác, mức độ nghiêm trọng của bệnh 1.1.3. Phân loại và đặc điểm vi khuẩn lao 1.1.3.1. Phân loại (20) Mycobacteria nằm trong số những vi khuẩn gây bệnh ở người được nghiên cứu đầu tiên. Chúng có mối liên hệ mật thiết với nhóm trực khuẩn Gram-dương bao gồm bộ Corynebacterium (bao gồm tác nhân gây bệnh C.diphtheriae), Nocardia (bao gồm tác nhân gây bệnh cơ hội N.asteroides) và Streptomyces. Tên Mycobacterium lần đầu tiên xuất hiện vào năm 1896, chỉ bao gồm 2 chủng – M.tuberculosis và M.leprae. Sau đó các chủng khác được định danh, trong đó một số ít được biết đến như là tác nhân gây bệnh, đặc biệt M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.marium, và M.ulcerans có thể gây bệnh trên người. Ngoài nhóm tác nhân M.tuberculosis và M.leprae, hầu hết các tác nhân gây bệnh cơ hội khác ~ 7 ~ …………………………………………………………………………………………………. hiếm khi gây bệnh trên người có hệ miễn dịch bình thường. Nhóm vi khuẩn đặc biệt quan trọng là nhóm M.avium-intracellulare có thể gây bệnh ở bệnh nhân AIDS. Bảng 1.1: Một số vi khuẩn mycobacteria có liên hệ với bệnh Nhóm vi sinh vật Bệnh ở người M.tuberculosis M.leprae M.avium - intracellulare M.scrofulaceum M.kansasii M.chelonae M.fortuitum M.simiae M.xenopi M.ulcerans M.marium C.diphtheria M.asteroids Bệnh lao Bệnh phong hủi Nhiễm trùng phổi, viêm hạch bạch huyết cổ tử cung , nhiễm trùng lan tỏa ở bệnh nhân AIDS Viêm hạch cổ tử cung Bệnh phổi mãn tính, viêm hạch bạch huyết cổ tử cung, bệnh về da Nhiễm trùng hậu phẫu; nhiễm trùng da và mô mềm Nhiễm trùng hậu phẫu; nhiễm trùng da và mô mềm Nhiễm trùng phổi Nhiễm trùng phổi Buruli ulcer Bệnh về da Bệnh bạch hầu Nhiễm trùng phổi Mycobacteria có thể chia thành 2 nhóm chính tuỳ thuộc vào tốc độ tăng trưởng trong phòng thí nghiệm in vitro: • Tăng trưởng nhanh, có thể tạo khuẩn lạc nhìn thấy bằng mắt thường trong 2-4 ngày • Tăng trưởng chậm, có thể cần 10 ngày hoặc lâu hơn nữa để tạo khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt thường Tốc độ tăng trưởng chỉ là một đặc điểm; có những đặc điểm khác để phân biệt 2 nhóm này, ví dụ hầu hết các chủng tăng trưởng nhanh có 2 bộ gene mã hoá RNA của ribosome, trong khi các chủng tăng trưởng chậm chỉ có 1. Các tác nhân gây bệnh thường thuộc nhóm tăng trưởng chậm. ~ 8 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hình 1.1: Cây phả hệ các chủng mycobacteria dựa trên trình tự 16S rRNA. (25) Sự phân chia thành mycobacteria tăng trưởng nhanh hay chậm phản ánh lịch sử tiến hoá của chúng. Nhánh tận cùng bằng một vòng tròn là gốc gắn vào cây phả hệ lớn hơn. Sự tăng trưởng chậm của M.tuberculosis khiến cho nghiên cứu sinh học cơ bản về M.tuberculosis phát triển chậm. Nhiều nghiên cứu vì vậy chỉ tiến hành trên các chủng tăng trưởng nhanh, với giả thuyết rằng chúng có những đặc điểm tương tự Tăng trưởng nhanh Tăng trưởng chậm ~ 9 ~ …………………………………………………………………………………………………. M.tuberculosis giúp cho sự hiểu biết của chúng ta tăng lên nhanh chóng. Chủng thường được nghiên cứu là M.smegmatis, và sau đó áp dụng vào M.tuberculosis. Bảng 1.2: Phức hợp M.tuberculosis và các đối tượng mắc bệnh liên quan M.tuberculosis M.africanum M.canetii M.microti M.bovis M.pinnipedii Bệnh lao ở người Bệnh lao ở người (hiếm gặp, chủ yếu ở châu Phi) Bệnh lao ở người (hiếm) Bệnh lao ở gặm nhấm (không gây bệnh cho người) Bệnh lao ở các động vật hữu nhũ, bao gồm gia súc, người, dê, trâu, mèo, heo, chó… Bệnh lao ở hải cẩu, chuột thí nghiệm guinea pigs, thỏ, người, và gia súc *M.microti thường được xem là không gây bệnh và trước đây sử dụng trong điều chế vaccine. Tuy nhiên, xác định kiểu gene cho thấy đôi khi chúng gây bệnh trên người. Các nghiên cứu mức độ phân tử đã chứng minh sự khác biệt trong di truyền của các chủng M.tuberculosis tồn tại ở các vùng khác nhau trên thế giới và có giả thuyết cho rằng các vi khuẩn lao cổ xưa đã tiến hoá thành các chủng hiện đại với độc tính tăng cường. Hiện nay nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để tìm hiểu sự khác biệt này và nhận dạng nhân tố gây độc để hỗ trợ việc thiết kế vaccine và tìm kiếm thuốc điều trị. Trên phương diện lâm sàng, nhóm vi khuẩn lao gây bệnh cho người được chia làm 2 loại: vi khuẩn lao điển hình Mycobacterium tuberculosis và vi khuẩn lao không điển hình (non-tuberculous mycobacteria), có thể có tên khác bao gồm MOTT (mycobacteria other than tubercle) và mycobacteria trong môi trường. Nếu xét về hình thái học, đặc điểm lâm sàng, dấu hiệu X-quang, dấu hiệu mô học thì 2 nhóm này không có gì khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên, hai nhóm vi khuẩn lao này lại khác nhau đáng kể khi đề cập về tình trạng nhiễm trùng, sinh hoá, sinh học phân tử, sự nhạy cảm với thuốc điều trị lao, khả năng gây bệnh, đáp ứng điều trị hiệu quả của điều trị dự phòng. ~ 10 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hiện nay, chủng vi khuẩn lao được các nhà di truyền học phân loại như sau: [the Comprehensive Microbial Resource webpage - scripts/CMR/CmrHomePage.cgi ] Giới Vi khuẩn Ngành Actinobacteria Lớp Actinobacteridae Bộ Actinomycetales Họ Corynebacterineae Chi Mycobacteriaceae Loài Mycobacterium tuberculosis 1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơ bản của mycobacteria (20) Mycobacteria thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, mặc dù chúng nhuộm màu yếu vì cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Chúng hiếu khí, không sinh bào tử và không di động. Mycobacteria không có plasmid, nhiều mycobacteriophage đã được phân lập. M.tb là trực khuẩn dài 3-5 μm, ngang 0,3-0,5 μm, không có lông mao, hai đầu tròn, có tính chất kháng cồn kháng toan. Trên tiêu bản nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen, các AFB bắt màu đỏ fuchsin, phân bố thành cụm hoặc đứng riêng rẽ (hình 1.2 A,B,C). Không chỉ như các vi khuẩn khác có peptidoglycan ở vách tế bào, vách vi khuẩn kháng cồn kháng toan Mycobacterium chứa nhiều glycolipid, đặc biệt là các mycolic acid. Phía ngoài màng sinh chất, vách M.tb gồm lớp peptidoglycan gắn với arabinogalactan (D-arabinose và D-galactose) và kết hợp với các mycolic acid. Lớp arabinogalactan/mycolic acid nằm dưới lớp polypeptide và các mycolic acid gồm lipid tự do, các glycolipid, và các peptidoglycolipid. Các glycolipid gồm lipoarabinomannan (LAM) và phosphatidyinositol mannoside (PIM) (hình 1.2 D). Các peptidoglycan, mycolic acid và glycolipid ngăn cản hoá chất thấm qua vách, vì vậy làm cho vi sinh vật sinh sản chậm và dễ kháng thuốc, khó bị thực bào tiêu diệt hơn các vi khuẩn khác. ~ 11 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hình 1.2: A. nhuộm Ziehl-Neelse,trực khuẩn M.tb đỏ B. nhuộm auramine,trực khuẩn M.tb vàng-cam C. M.tb qua kính hiển vi điện tử D. Lớp vỏ của vi khuẩn kháng cồn kháng toan Phân tử mycolic acid và phân đoạn peptidoglycan gắn với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt đại thực bào vật chủ, làm cho đại thực bào tiết ra các cytokine như tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gây phản ứng viêm tiêu diệt M.tb. Điều kiện sống của vi khuẩn lao (20) Ở điều kiện bình thường vi khuẩn lao sinh sản chậm (trung bình 20-24 giờ/chu kì). Vi khuẩn nằm ở vùng tổn thương có khi hàng tháng không bị chết, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng lại phát triển. Cách sinh sản của vi khuẩn thông thường là phân đôi tế bào, nhưng M.tb có thể sinh sản theo kiểu bào tử giống như nấm. Trong không khí, khi không có các yếu tố bất lợi, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng. Trong phòng thí nghiệm vi khuẩn có thể được bảo quản trong nhiều năm ở -70oC. Dưới ánh nắng mặt trời vi khuẩn chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 42oC, vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 80oC. Đàm của bệnh nhân lao sau 3 tháng trong phòng tối, ẩm vẫn còn vi ~ 12 ~ …………………………………………………………………………………………………. khuẩn tồn tại và giữ được độc lực, đun sôi đàm trong 5 phút M.tb chết, với cồn 90oC vi khuẩn tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1 phút. Để vi khuẩn lao có thể phát triển thuận lợi, trong điều kiện phòng thí nghiệm, môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng như môi trường Lowenstein-Jensen. Bên cạnh đó, M.tb phát triển tốt nhất ở môi trường có pH 6,2-7,2, chúng cũng có thể phát triển được trong môi trường pH acid 5,5, kiềm 8,0. Vi khuẩn lao có thể phát triển ở 29-42oC (thuận lợi nhất là 37-38oC). Sau khi nuôi cấy 4-6 tuần trong môi trường LJ có thể quan sát được khuẩn lạc. Cơ chế M.tb xâm nhập và gây bệnh (18) Vi khuẩn lao tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí. Khi được hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào được hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp kềm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát được vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đường máu và đường bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau như phổi, thận, não, xương (giai đoạn lao bệnh). Trong lao màng não, trực khuẩn lao theo đường máu đến màng não. Sau giai đoạn tiềm tàng, yên lặng trong nhiều tuần, nhiều tháng hoặc nhiều năm, trực khuẩn lao phát triển thành các hạt lao, củ lao. Khi có kích thích như kích thích do chấn thương, tình trạng miễn dịch thay đổi, trực khuẩn lao và các kháng nguyên chứa trong các củ lao được giải phóng vào các khoang màng não gây bệnh. Các yếu tố của M.tb độc tính đối với vật chủ (18) Mycobacterium tuberculosis không có các độc tố thường thấy như ở các vi khuẩn khác như chất độc, vỏ ngoài (capsules fimbriae). Tuy nhiên, nhiều đặc điểm về cấu trúc, sinh lý của loại vi khuẩn này biểu hiện độc tính vi khuẩn và khả ~ 13 ~ …………………………………………………………………………………………………. năng sinh bệnh lao. M.tb có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. Trực khuẩn lao có thể gắn trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã được mannose hoá trên vách (cell wall-associated mannosylated glycolipid), LAM (lipoarabinomannan), hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông thường khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian chất oxy hoá tiêu diệt. M.tb biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp phagosome với lysosome. Vách Mycobacterium có loại mycolic acid là lipid chuyên biệt nhánh alpha, những phân tử kị nước mạnh, hình thành lớp vỏ lipid bao quanh vi sinh vật , ảnh hưởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế bào. Cho đến nay người ta cho rằng mycolic acid là nhân tố chính quyết định độc tính của M.tb, có thể nhờ đó mycobacteria tránh được các protein tích điện dương, lysozyme và các gốc tự do trong các hốc thực bào, giúp mycobacteria ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ thể trong huyết thanh. Một trong những sản phẩm liên kết mycolic acid với các chất lipid phức tạp là cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Chủng M.tb độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố thừng này (Cord factor). Yếu tố quyết định khả năng M.tb lây truyền (18) Về mặt dịch tễ học, những bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây bệnh cho người khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào - số lượng vi sinh vật thoát ra ngoài môi trường - mật độ vi sinh vật trong không khí - thời gian vật chủ phơi nhiễm không khí đã bị ô nhiễm - tình trạng miễn dịch của từng cá thể như ở bệnh nhân nhiễm HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng trầm trọng khi bị nhiễm M.tb. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh nhân này không cao. Những lợi điểm giúp M.tb gây bệnh rất phức tạp và chưa được hiểu đầy đủ. Các bằng chứng thực nghiệm cho thấy các chủng vi khuẩn có độc tính khác ~ 14 ~ …………………………………………………………………………………………………. nhau, đột biến trên những gen nhất định đã ảnh hưởng đến độc tính của vi khuẩn. Người ta vẫn chưa biết liệu có những chủng nào dễ gây bệnh đối với hệ thống thần kinh trung ương hay không. Arvanitakis và cộng sự (6) nghiên cứu kết quả RFLP của một nhóm bệnh nhân lao ở hệ thống thần kinh trung ương, trong đó lao màng não chiếm đa số do một chủng gây bệnh chiếm ưu thế, tuy nhiên cơ chế vi khuẩn lao gây bệnh ở hệ thần kinh vẫn chưa được hiểu rõ. Đồng nhiễm lao và HIV (Human Immunodeficiency Virus) Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HIV đang ngày càng gia tăng, đến năm 1996 đã có khoảng 1,5 triệu người chết mỗi năm vì HIV trên toàn cầu, đến năm 1999 đã có khoảng 30 triệu người nhiễm. Bên cạnh đó, theo UNAIDS, tại TPHCM, những người nhiễm lao ngày càng có khuynh hướng nhiễm HIV, trong năm 1997 số bệnh nhân lao nhiễm HIV là 0,9%, nhưng đến năm 2002, tỷ lệ này tăng đến 9,4%. Tỷ lệ chữa trị khỏi cho những trường hợp này khoảng 50%, tỷ lệ tử vong cao hơn 30%. HIV và lao, hai tác nhân truyền nhiễm này tương tác với nhau dẫn đến những kết quả đáng quan tâm về mặt sinh bệnh học, lâm sàng và dịch tễ. Cơ thể vật chủ đáp ứng với M.tuberculosis hữu hiệu nhờ miễn dịch qua trung gian tế bào, nhưng cũng chính loại đáp ứng miễn dịch này bị HIV làm biến đổi nhiều nhất vì tế bào chủ của HIV là tế bào CD4 và đại thực bào. Khả năng cơ thể phản ứng kháng sự tiến triển lao trong giai đoạn sơ nhiễm hay sự tái hoạt động của vi khuẩn nhiễm tiềm tàng tương xứng với mức độ ức chế miễn dịch liên quan đến nhiễm HIV. Khi bệnh nhân đồng nhiễm HIV-1 tiến trình M.tb xâm nhiễm cũng bị biến đổi. Bệnh nhân nhiễm HIV-1 tăng nguy cơ nhiễm M.tb từ bên ngoài gấp 20 lần, khả năng M.tb tiềm tàng trỗi dậy tăng cao, dễ mắc lao ngoài phổi (24). Vi khuẩn lao và virus HIV có tác dụng tăng cường khả năng xâm nhiễm lẫn nhau. HIV thúc đẩy sự phân chia và phát triển của M.tuberculosis trong cơ thể vật chủ và ngược lại, có những bằng chứng cho thấy M.tuberculosis giúp HIV nhân bản nhanh in vivo và in vitro (11). ~ 15 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1.1.4. Bộ gene vi khuẩn lao (10) Hình 1.3: Chromosome của M.tuberculosis H37Rv. Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho M.tb, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene RNA ổn định, trình tự DR đại diện bằng hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ - xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt). Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự DNA lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65%. 1.1.4.1. Cấu trúc bộ gene vi khuẩn lao Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự (10), toàn bộ trình tự của Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv đã được giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và điều trị bệnh. Toàn bộ bộ gene gồm 4 411 529 bp chứa khoảng 4000 gen, với tỷ lệ GC cao khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong bộ gene ~ 16 ~ …………………………………………………………………………………………………. giữa M.tuberculosis với những vi sinh vật khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại. M.tuberculosis thường kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việ